197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
35 197357 36 ségü centrifugálásból áll első lépésként, végül kinyerjük az aktív fehérjét. A 10. és 11. példa azt is bemutatja, amikor a levegőt használjuk diszulfidképző reagensként, miután hagytuk, hogy a fehérje megfelelő konformációja kialakuljon redukálószer jelenlétében; továbbá az erősen denaturáló oldatoknak azt a képességét, hogy feloldják a fénytöréssel rendelkező testeket; valamint az oldhatóság fenntartását az erős denaturálószernek gyengébb denaturálószerrel való kicserélésével. A 12., 13. és 15. példában azt mutatjuk be, amikor a legalább is részben inaktív fehérje megfelelő konformációját szulfitolizissel, majd redox pufferben végzett kezeléssel alakítjuk ki. A 14. példából a redox pufferrel történő konformáció kialakítás tűnik ki. A 16. példa az erősen denaturáló oldattal történő oldás, majd gyengébb denaturálószerrel végzett puffercsere hatékonyságát szemlélteti. Valamennyi példában olyan heterológ fehérjék szerepelnek, amelyek tisztítása a találmány szerinti eljárással történt. A tisztítással kapcsolatos részletek természetesen eltérnek az egyes fehérjéknél. Jóllehet a találmány szerinti eljárás mindegyik esetben hasonló, egyes részletek, például a kívánt fehérje szolubilizálásához használt denaturálószer, a megfelelő gélek vagy ioncserélő gyanták valamint az egyes lépéseknél alkalmazott ionerősség és pH, függnek az illető fehérje tulajdonságaitól. A fénytöréssel rendelkező fehérjéknek azonban elegendő közös jellemzőjük van ahhoz, hogy ezek a kisebb eltérések hozzáigazíthatók legyenek az eljáráshoz a szóban forgó fehérjénél. 1. példa Heterológ fehérjék termelése és elkülönítése A. Sejtek szaporítása Escherichia coli K-12 sejteket, amelyeket az Escherichia coli trp promotor-operátor irányítása alatt levő heterológ géneket hordozó pBR 322 rekombinált plazmiddal transzformáltunk, olyan táptalajon szaporítottunk amely 10 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 triptont tartalmazott. A szaporítást 2-4x10® sejt/ml sejtsűrűségig végeztük. A kapott tenyészet térfogatának 3-5%-át bevittük M9 táptalajba (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 431. oldal, Cold Spi-ing Harbor Laboratov, 1972) vagy hasonló, ásványi sókat tartalmazó táptalajba, amelyben 40- -120 mg/1 triptofán is jelen volt. A tenyésztést fermentorban folytattuk olyan mértékű mozgatás és levegőztetés mellett, hogy 60-90 perc/sejtosztódás növekedési sebességet érjünk el. Glukózt adtunk a tenyészethez a növekedés fenntartására, ügyelve azonban arra, hogy a glukóz koncentrációja a fermentálás alatt ne lépje túl az 50 g/1 értéket. A tenyészet pH-ját 6,8-7,2 értékre állítottuk be nátrium-hidroxiddal vagy ammónium-hidroxiddal. 5-10 g száraz súly/liter sejtmennyiségnél indolil-akrilsavat (IAA) vagy indolil-propionsavat (IPA)) adtunk a tenyészethez 25-50 mg/1 koncentrációban. Az IAA vagy IPA hozzáadása után 2-5 órával az Escherichia coli sejtek megnyúltakká váltak, és sejtenként egy vagy több, fénytöréssel rendelkező testet figyeltünk meg fáziskontraszt mikroszkóp alatt 1000-szeres nagyítás mellett. B. A heterológ fehérje elkülönítése Az egyes tenyészeteket folyamatos centrifugálással különítettük el, és a sejtpépet megfagyasztottuk -10 és -20 °C közötti hőmérsékleten. (Kívánt esetben az elkülönités előtt elpusztíthatjuk a sejteket olyan módon, hogy 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk a táptalajhoz, és 0,5 órán át inkubáljuk 37 °C-on - lásd a 9. példát.) A frissen elkülönített vagy megfagyasztott sejtpépet pufferoldatban szuszpendáltuk, amely 10 mM trisz(hidroxi-nietil)-amino-metánt és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott, és a pH-értéke 7,4 volt. 1 g sejtpép szuszpendálásához 10-40 ml pufferoldatot használtunk. A szuszpenzióban a sejteket ultrahanggal végzett kezeléssel vagy nagy nyomás alatti homogenizálással bontottuk meg. Fáziskontraszt mikroszkóp alatt a fénytöréssel rendelkező részecskék láthatók voltak a sejttörmelék között. Az 1. ábrán olyan Echerichia coli K-12 3110 törzs (ATCC-száma 27 325) sejtjeinek fáziskontraszt mikroszkópon keresztül készült fényképe látható, amely a pUK 33 trp LE2 plazmiddal volt transzformálva, és amely a 33 000 molekulatömegű urokinázt tartalmazó összekapcsolt fehérjét termel. (A fenti plazmiddal transzformáit Escherichia coli törzset a 368 773 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 92 182 számú európai szabadalom írta le, a bejelentés napja 1982 április 15.) A fényképen a fénytöréssel rendelkező testek fényes foltokként jelennek meg a sejten belül. A szuszpenziót 3-10 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 1000-szersének megfelelő értéken (Sorlvall SS-34 centrifuga, 3000 fordulat/perc). A centrifugálás befejezése után a felülúszó folyadékot elöntöttük, a szemcsét pedig ugyanebben a pufferoldatban szuszpendáltuk, az eredeti térfogat 1/5 részének megfelelő mennyiséget használva belőle. A szuszpenziót fáziskontraszt mikroszkóp alatt vizsgáltuk. Ha sértetlen sejtek vagy látható sejttöredékek voltak megfigyelhetők, a fenti eljárást addig ismételtük meg, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 19
