197357. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására
31 197357 32 Amint azt a 2. folyamatábra mutatja, ez a találmány szerinti eljárás alapvetően a kővetkezőkből áll. A sejtpépet 0,05-2,0 M közötti, előnyösen 0,4-0,6 M közötti ionerősségű pufferoldatban diszpergáljuk annak érdekében, hogy tökéletessé tegyük vagy fenntartsuk a heterológ fehérje kicsapását és feloldjuk a gazdasejtfehérje főtömegét vagy fenntartsuk annak oldhatóságát. A gazdasejtfehérjétöl történő elválasztás után a heterológ fehérjét redukálószert tartalmazó, erősen denaturáló oldatban oldjuk. Az eljárás akkor fejeződik be, amikor puffercsere útján a heterológ fehérjét biológiailag aktiv alakban nyerjük ki. A gélszűrésből és az ioncseréből álló 3. és 4. lépés fakultatív. Ezeket kívánt esetben alkalmazzuk, ha esetenként további tisztításra van szükség. A kiindulási anyagul szolgáló sejtanyag lehet az egész tenyészet vagy annak koncentrált alakja, például sejtpép. Gazdasejtekként előnyösek a baktériumtenyészetek, különösen az Escherichia coli tenyészetei. Jelenleg előnyös, ha olyan sejtpépet használunk, amelynél a baktériumokat előzetesen elpusztítottuk, ilyen módon eleget téve a biztonsági rendszabályoknak. (A találmány szerinti eljárás mind elölt, mind pedig elöletlen gazdasejtekból történő fehérjekinyerésre alkalmas). Előnyösen úgy járunk el, hogy a sejttenyészethez, miután a tenyésztést 30-50 közötti optikai sűrűség egység eléréséig végeztük 550 nm hullámhosszúságon, mintegy 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk, s mintegy 30 percig állni hagyjuk. Ezzel eredményesen pusztíthatjuk el a sejteket anélkül, hogy szükségtelenül denaturálnánk a sejtfehérjét. Hőközléssel és savak alkalmazásával a sejtek szintén hatékonyan elpusztíthatok, ezek a módszerek azonban kevésbé előnyösek, jóllehet a találmány szerinti eljárásnál az említett vagy más elpusztító módszerek felhasználhatók. Az elpusztított sejteket ezután vagy a teljes tenyészet alakjában vagy centrifugált sejtekként vetjük alá a találmány szerinti eljárás műveleteinek. Gyakorlati szempontból előnyös a cintrifugálással kapott sejtpép alkalmazása, mivel ekkor kisebbek a térfogatok. A sejttenyészetet vagy sejtpépet fagyasztásnak is alávethetjük a tisztítás előtt, pusztán az egyszerűség kedvéért. A kezdeti extrakció során (a 2. folyamatábra 1. lépése) a sejteket egy olyan pufferoldatban diszpergáljuk alaposan, amelynek a pH-értéke 4-10, előnyösen 6-9, és ionokat tartalmaz úgy, hogy az ionerőssége 0,05-2,0 M, előnyösen 0,4-0,6 M. Bármilyen alkalmas pufferrendszert használhatunk. Az ionerősséget bármilyen sóval biztosíthatjuk, a pufferoláshoz használt sókat is beleértve, a gazdaságossági szempontból azonban előnyös a nátrium-klorid használata. Emellett kívánatos, hogy a pufferoldat kelátképző szert, például etilén-diamin-tetraecetsavat és redukálószert, például 2-merkapto-etanolt is tartalmazzon. A fenti lépés kivitelezésekor igen kívánatos, hogy egységes szuszpenziót kapjunk. Sejtpép alkalmazása esetén előnyös a mechanikai diszpergálás. Erre a célra beszerezhetők a kereskedelmi forgalomból diszpergáló gépek; előnyösen a Dispax Model SD 45 (gyártó: Tekmar Inc.). Sejttenyészet alkalmazása esetén szükségtelen a mechanikai diszpergálás. Tekintettel arra, hogy a kicsapott heteí-olog (fénytöréssel rendelkező) fehérje rendszerint a sejteken belül helyezkedik el, az 1. lépésben nyert sejtszuszpenzió homogenizálására is szükség van olyan típusú homogenizáló vagy prés alkalmazásával, amely valóban megbontja a sejtek egészét. Többféle berendezés vagy módszer alkalmazható erre a célra, például francia prés vagy golyós malom vagy ultrahanggal történő kezelés. Előnyős azonban a Manton-Gaulin 15 N típusú homogenizáló készülék. Miután a sejteket a pufferoldatban diszpergáltuk és homogenizáltuk a leirt módon, az oldhatatlan anyagot előnyösen centrifugálással választjuk el az oldható fehérjéktől, és a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. A felülúszó folyadékot, amely elsősorban a gazdasejt fehérjéit tartalmazza, elöntjük. Előnyösen a kapott üledéket mossuk hasonló pufferoldatban történő diszpergálással, hogy még jobban eltávolítsuk a gazdasejt anyagát az üledékben lévő oldhatatlan fehérjétől. A mosást a szokásos módon végezzük, az üledéket friss pufferoldatban diszpergáljuk és újból centrifugáljuk. Az üledéket ezután a 2. lépés értelmében extraháljuk a kívánt heterológ fehérjék kinyerése érdekében. Az üledéket erősen denaturáló oldatban diszpergáljuk az 1. lépésben alkalmazott hasonló módon. Az ehhez használt oldat előnyösen 1-9 mólos, különösen előnyösen 6-8 mólos az erősen denaturáló anyagra nézve, amely például egy guanidinsó. Emellett az oldat annyi foszfát puffert vagy más alkalmas pufferanyagot tartalmaz, hogy a pH-értéke 4-10, előnyösen 6-9, különösen előnyösen 7 körüli legyen. Továbbá előnyös, ha az oldatban kis mennyiségű kelátképző szer, például etilén-diamin-tetraecetsav is jelen van. Az oldatban redukálószerre, például béta-merkapto-etanolra is szükség van, annak biztosítására, hogy az esetleges diszulfid-kótések szabad szulfhidrilcsoportokká alakuljanak. Természetesen más denaturálószereket is használhatunk. A diszpergálás folyamán a szemcséket legfeljebb 24 órán át, előnyösen egy éjszakán át keverjük a denaturáló oldattal. A szuszpenziót ezután centrifugáljuk, és kidobjuk a szemcsét, amely feloldatlan és ki5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 17
