197355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szignálszekvencia előállítására proteinek transzportjára, expressziós rendszerekben
2 197355 3 A proteineket a sejtben a citoplazmában elhelyezkedő riboszómák szintetizálják. A citoplazmából kilépő proteinek amino-végén egy viszonylag rövid peptidlánc van, amelyet a citoplazma-membránon történő átlépéskor bizonyos enzimek leválasztanak, és igy keletkeznek az úgynevezett .érett’ proteinek. A rövid, lehasadó peptidszekvenciát .szigriálpeptid'-nek vagy pre-, illetve leader-székvenciának nevezzük. Már sok esetben jellemezték a kiválasztódó proteinek amino-végén elhelyezkedő szignál-szekvenciát. Ez lényegében 10-20 aminosavat tartalmazó .core’-nek nevezett hidrofób részből áll, amelynek amino-végén legtöbbször egy (vagy több) pozitiv töltésű aminosavat tartalmazó rövid peptid-szekvencia van (.pre-core"). A hidrofób rész karboxi-vége és az .érett' protein amino-vége között is van egy rövid peptid-szekvencia (.post-core'), amely hasítási helyet (.splice-site") tartalmaz és a kedvező térbeli elhelyezkedést biztosítja. A 4 411 994 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi közlemény ir le olyan eljárást, amelynél a kiválasztandó protein génjét egy extracelluláris vagy periplazmatikus vivő-proteinnek megfelelően kódolt bakteriális génhez kapcsolják annak érdekében, hogy a kívánt protein kijuttatását a citoplazmából lehetővé tegyék. Ehhez az eljáráshoz izolálni kell egy olyan, a gazdaszervezetnek megfelelő, bakteriális gént, amely egy periplazmatikus, .outer membrane’ vagy exktracelluláris proteinnek megfelelően van kódolva. Ezt a gént ezután restrikciós enzimmel hasítják, a képződött hasítási helyre csatolják a kiválasztandó protein génjét és a gazdasejtet az így előállított, egyesített gént tartalmazó vektorral transzformálják. Az ismert eljárás hátránya, hogy a természetes gén izolálása és az alkalmas hasítási hely kiválasztása érdekében történő jellemzése rendkívül munkaigényes. Találmányunk szerint az eljárás munkaigényességét úgy csökkentjük, hogy szintetikus szignál-szekvenciát alkalmazunk. A találmány tárgya eljárás szintetikus szignál-szekvencia előállítására, proteinek transzportjára, expressziós renszerekben, azzal jellemezve, hogy a szintetikus DNS lényegében egy természetes szignál-szekvenciának felel meg, de egy vagy több olyan, az endonukleázok számára hozzáférhető hasítási helyet tartalmaz, amelyek a természetes DNS-ben nem találhatók meg. A találmány szerinti DNS .lényegében" felel meg egy természetes szignál-szekvenciának. Ez alatt azt értjük, hogy az exprimált szignél-peptid a természetessel a legmesszebbmenőkig vagy teljesen megegyezik, tehát az utóbbi esetben csak a DNS síkon van különbség, mégpedig annyiban, hogy a szintetikus DNS legalább egy olyan hasítási helyet tartalmaz, amely a természetes DNS-szekvenciában nem fordul elő. A találmány szerinti hasítási hely beépítése kisebb vagy nagyobb mértékű eltérést okoz a természetes szekvenciától, amit az adott körülmények között azokra a kodonokra kell visszavezetnünk, amelyeket a mindenkori gazdasejt kevésbé kedvel. Meglepő viszont, hogy ezzel az expressziónál semmiféle hátrány nem jár. A szintetikus gén eltervezett .mértékutánisága* sokszor annyi előnynyel jár, hogy a .természettől idegen’ kodon alkalmazásának esetleges hátrányait általában bőségesen túlkompenzálja. Sőt azt tapasztaltuk, hogyha az E. coli lúgos foszfatáz enzimjének génjében előforduló GTG startkodont ATG-re cseréljük, akkor ez erősen megnöveli az expressziót. A találmány lényeges előnye, hogy a gazdasejtnek kevesebb ballaszt-proteint kell termelnie, mivel az exprimálandó gént közvetlenül a szintetikus DNS-szignálszekvencia 3’ végéhez csatolhatjuk. További előnye a találmánynak, hogy a szintetikus DNS-t a felépítésekor a végeken kiálló, a restrikciós enzim meghatározott felismerő helyének megfelelő DNS-szekvenciákkal láthatjuk el, amelyek lehetővé teszik a szintetikus DNS klónozását úgy, hogy több, különböző felismerő hely esetében a DNS csak egyféle, meghatározott módon épülhet be a klónozó vektorba, igy lehetőség van az .épitőszekrény elv' alapján tetszőleges vektorba történő beépítésre. A restrikciós enzimeknek megfelelő belső felismerési helyek lehetővé teszik tetszőleges * homológ vagy heterológ gének csatolását a helyes leolvasó vázszerkezetben. Ezeken a belső hasítási helyeken egyszerű módon vezethetünk be variációkat a szignál-szekvencia DNS-ébe, és ezek a variációk a természetben elő nem forduló preszekvenciákhoz vezetnek. Ezeket a belső hasítási helyeket célszerűen a hidrofób rész előtt vagy után építjük be, előnyösen a .post-core’-tartományba, emellett a hasítási helyeket és/vagy azok környezetét modifikálhatjuk. A G. von Heijne: J. Mól. Bioi. 173 (1984) 243-251. oldal irodalmi közleményben leírt, ismert szabályok figyelembe vételével a prepeptid karboxi-terminális részét kódoló génszeletben alkalmazott, és megfelelően megválasztott hasítási helyekkel a szignál-peptidák hasítási helyeket úgy tervezhetjük, hogy ne a fúziós protein, hanem közvetlenül a kívánt, általában eukariotikus, természetes formájú peptid exprimálódjék. A természetes eredetű gének általában ilyen folyamatokat nem tesznek lehetővé. A találmány szerinti eljárásnál minden, az irodalomban [M.E.E. Watson: Nucleic Acids Res. 12 (1984), 5145-5164. o,] leirt szignál-szekvencia, ezek variációi, valamint a belőlük levezetett, és a D. Perlmann és H.O. Halvorson: J. Mól. Bioi. 167 (1983), 391-409. o. irodalmi közleményben leirt .idealizált’ szignál-szekvenciák alkalmazhatók. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
