197354. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó streptomyces kiválasztására.
2 197354 3 A jelen találmány tárgya eljárás rekomblnáns DNS-t tartalmazó gazdasejt kiválasztására! valamint azok a rekombináns DNS klónozó vektorok ás transzformánsok, amelyek ennek a módszernek a kivitelezésében használhatók. A módszer tilozin-rezisztencia-átvivó klónozó vektorokat hasznosít Streptomycesben való alkalmazáshoz. A rekombináns DNS technológia fejlődése és kihasználása Streptomycesben függ a szelektálható genetikai markerek hozzáférhetőségétől megfelelő klónozó vektorokon. Ezt a fejlődést valamelyest hátráltatja a jelenleg hozzáférhető szelektálható markerek kis száma Streptomycesben való felhasználásra. A jelen találmány hasznos és különösen fontos annyiban, hogy növeli az ilyen alkalmazásra megfelelő szelektálható markerek számát. A jelen módszer szerint alkalmazott vektorok különösen, hasznosak, mivel kicsinyek, sokoldalúak és transzformálhatók és szelektálhatok bármilyen Streptomyces sejtben, amely érzékeny tilozinra. A Streptomyces szolgáltatja több, mint felét a klinikailag fontos antibiotikumoknak és így ez iparilag és kereskedelmileg fontos csoport. A jelen találmány új és hasznos klónozó rendszereket és vektorokat szolgáltat ehhez az iparilag fontos csoporthoz és lehetővé teszi a gének klónozását mind ismert antibiotikumok kitermelésének növelése, mind új antibiotikumok és antibiotikum-származékok termelése érdekében. A találmány szerinti eljárás a Streptomyces transzformánsok kiválasztását teszi lehetővé a nem transzformált sejtek hátteréből. A jelen módszer lehetővé teszi, hogy nem szelektálható DNS-t adjunk hozzá a jelen vektorokhoz, transzformáljuk a Streptomycest a módosított vektorokkal és kiválasszuk az ezeket az egyébként nem szelektálható DNS-eket tartalmazó tilozin-rezisztens transzformánsokat. Mivel a transzformálás nagyon kis gyakoriságú esemény, egy ilyen funkcionális vizsgálatnak nagy a szükségessége annak meghatározásában, mely sejt vagy sejtek fogadták be a transzformáló DNS-t a sejtek milliói közül. A jelen találmány céljaira az alább definiált kifejezéseket alkalmazzuk mind a leírásban, mind az igénypontokban. Rekombináns DNS klónozó vektor: bármiféle függetlenül replikálódó vagy integrálódó ágens, beleértve (de nem korlátozva ezekre) a plazmidokat, amely olyan DNS molekulát tartalmaz, amelyhez egy vagy több további DNS szegmenst lehet adni, vagy ilyen szegmens van már hozzáadva. Transzformálás: DNS bevezetése egy befogadó gazdasejtbe, amely DNS megváltoztatja a genotípust és változásokat hoz létre a befogadó sejtben. Transzfektáns: befogadó gazdasejt, amelyet fág DNS-el való transzformálásnak vetettünk alá. Transzformáns: befogadó gazdasejt, amelyet transzformálásnak vetettünk alá. Érzékeny gazdasejt: olyan gazdasejt, amely nem nő egy adott antibiotikum jelenlétében egy olyan DNS szegmens nélkül, amely erre az antibiotikumra rezisztenciát nyújt. Restrikciós fragmens: bármilyen lineáris DNS molekula, amely egy vagy több restrikciós enzim tevékenysége által keletkezett. Fazmid: rekombináns DNS vektor, amely működhet mint fág, vagy működhet, mint plazmid. ApB: az ampicillin-rezisztens fenotípus tsrR: a tiosztrepton-érzékeny fenotípus tylR: a tilozin érzékeny fenotípus TcR: a tetraciklin-érzékeny fenotípus mel: a tirozináz-gén A jelen találmány módszert nyújt rekombináns DNS-t tartalmazó Streptomyces gazdasejtek kiválasztására, amely módszer abból áll, hogy: a) egy tilozinra érzékeny, restrikció nélküli Streptomyces gazdasejtet, amely fogékony transzformációra, sejtosztódásra és tenyésztésre a gazdasejtben önálló replikálódásra és integrálódásra képes rekombináns DNS klónozó vektorral transzformálunk, ahol is az említett vektor olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely tilozinra való rezisztenciát visz át, és b) a transzformált sejteket a tilozin-rezisztenciára való kiválasztáshoz alkalmas körülmények között növesztve tenyésztjük. A jelen találmány azokra a vektorokra és transzformánsokra is vonatkozik, amelyeket a fentebb említett módszer gyakorlati kivitelezésében alkalmazunk. A jelen módszert Streptomyces transzformánsok kiválasztásához tilozin-rezisztens fenotípus segítségével legjobban úgy lehet példával szemléltetni, hogy Streptomyces lividans TK23-at transzformálunk pSVB2 plazmiddal és az így létrejött transzformánsokat tilozin-tartalmú tápközegen kiválasztjuk. A pSVB2 plazmid egy új tilozin-rezisztencia-átvivő gént tartalmaz, amelyet Streptomyces fradiaeből izoláltak és pIJ702 plazmidba klónoztak. A pSVB2 plazmidot a Streptomyces lividans TK23/pSVB2-ből nyerhetjük, amely törzs letétbe van helyezve és részét képezi a Northern Regional Research Laboratory állandó törzstenyészet gyűjteményének NRRL 15 8£0 letéti számon (Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, 1815 North University Street, Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61 604, Amerikai Egyesült Államok). A pSVB2 plazmid restrikciós hely- és funkciós térképét & mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be. ámint az 1. ábrán bemutatjuk, a pSVB2 plazmid mintegy 2,6 kb-s ApnI restrikciós 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 55 3
