197352. lajstromszámú szabadalom • Eljárás pHJL 210 plazmid és más, ezzel összefüggő kétfunkciós klónozó vektorok előállítására Streptomycetesben való alkalmazáshoz
18 197352 19 3. példa A Streptomyces griseofuscus (pHJL2200 és S griseofuscus) pHJL2202 megalkotása A. Tenyészetek növesztése protoplasztok előállításához Hagyományos módon vegetatív inokulumot állítunk elő S. Griseofuscus növesztésével, amely törzs el van helyezve az American Type Culture Collection (ATCC) állandó törzstenyészet-gyűjteményében (Rockville, Maryland 20852), amelynek részét képezi, és ahonnan rendelkezésre áll a közönség részére ATCC 23 916 letéti számon. A növesztést süllyesztett körülmények között végezzük 20 órán át 30 °C hőmérsékleten TSB-ben*, amely 0,4% glicinnel van kiegészítve. A S. griseofuscus protoplaszt-képzése időt rabló művelet, amelyet általában a következők szerint hajtunk végre. Leoltunk csikókban S. griseofuscust egy YMX agart tartalmazó lemezre (0,3% élesztőkivonat, 0,2% glükóz és 2% agar). Mintegy 48 óra múlva egy egyedi baktérium-telepet inokulálunk 10 ml TSB-be*; homogenizálunk, majd inkubálunk 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át. Ezután 4 ml egy éjszakán át nőtt tenyészetet homogenizálunk, és hozzáadunk 100 ml 0,4% glicinnel kiegészített TSB-t, és egy éjszakán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A következő délutánon ezt a műveletet megismételjük, friss, egy éjszakán ét nőtt tenyészetet alkalmazva. A következő reggelen hozzáadunk 50 ml 50%-os (térf.//térf.) glicerint a tenyészethez, és 15 ml mintát lefagyasztunk -20 °C hőmérsékleten. A fagyasztott sejteket hat hónapon át tároljuk, és ezt használjuk a transzformációhoz. A fagyasztott sejteket felengedtetjük a csövet szobahőmérsékleten egy vizes főzőpohárba helyezve. A sejteket asztali centrifugával kinyerjük és háromszor mossuk 10 ml 10,3%-os szacharózzal. A sejt-szemcséket újra szuszpendáljuk 10 ml P tápközeggel [Hopwood és Wright: J. Molecular and General Genetics, 162, 307 (1978)], amely lízozimmal (1 mg/ml) van kiegészítve, és 30 °C hőmérsékleten két órán át inkubáljuk. A protoplasztokat szemcsékké centrifugáljuk, és a szemcséket háromszor mossuk 10 ml P tápközegben olyan módon, hogy vortex-keverővel felkeverjük, és a szemcséket az oldatba pipettázzuk minden egyes mosásnál. A végső szemcséket 2 ml P tápközegben újra szuszpendáljuk az ezt követő transzformációhoz. * A TSB-t (Triptikáz szója tápleves) a Dífco Laboratories-től nyerjük (Detroit, Michigan), vagy a Baltimore Biological Laboratories-től (P.O.Box 243, Cockeysville, Maryland, 21 031). B. Transzformálás Mintegy 10 m1 plazmid DNS-t ligáló pufferban és mintegy 150 pl S. griseofuscus protoplasztot keverünk enyhén egy kémcsőben. Ehhez a keverékhez hozzáadunk mintegy 101 pl 50%-os PEG 1000-t (polietilén-glikol, Sigma) P tápközegben, a keverékhez pipettázva. 1-2 perc várakozás után P tápközeget adunk hozzá, 1 ml-re egészítve ki a keveréket. A transzformált sejteket R2 tápközegre helyezzük és egy éjszakán át inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A regenerálódó protoplasztokra rárétegezünk 3 ml R2 rárétegezó közeget, amely 400 Mg/ml tiosztreptont tartalmaz, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk legalább 4 napon ét. Az így létrejött S. grisecfuscus/pHJL2200 tiosztrepton-rezisztens telepeket ismert módszerek szerint izolálhatjuk, majd tenyésztjük és hagyományos módor azonosítjuk a 3 C példában található kitanítással összhangban. A transzformáns tenyészeteket alkalmazhatjuk ez után az ezt követő plazmid DNS termeléshez és izoláláshoz. A S. griseofuscus/pHJL2202 transzformál sokat tiosztrepton- és neomicin rezisztenciára úgy választhatjuk ki, hogy a regeneráló protoplasztokra 50 Mg/ml neomicinnel és 400 Mg/ml tiosztreptonnal kiegészített R2 rárétegezó közeget rétegezünk. Az igy létrejött S. griseofuscus/pHJL2202 tiosztrepton- és neomicin rezisztens telepeket ismert módszerek szerint izoláljuk, majd azonosítjuk a 3 C példában található kitanitással összhangban. C. A S. griseofuscus transzformánsok elemzése Az így létrejött transzformánsokat YMX agai-on tenyésztjük (0,3% élesztókivonat, 0,3% maiétakivonat, 0,2% glükóz és 2% agar), amely tiosztreptonnal van kiegészítve (40 Mg/ml), olyan Diódon, hogy egyedi telepeket nyerjünk. Ezeket a telepeket használjuk 10 ml-es, 40 Mg/ml tiosztreptonnal kiegészített TSB tenyészetek inokulálására. A tenyészeteket homogenizáljuk és egy éjszakán ét növesztjük 30 °C hőmérsékleten rézógépen. A tenyészetet homogenizáljuk és hozzáadjuk 200 ml olyan TSB tenyészethez, amely 0,4% glicint és 40 Mg/ml tiosztreptont is tartalmaz, és egy vagy két napig növesztjük 30 °C hőmérsékleten. A sejteket azután Sorvall GSA rotorban kinyerjük 10 000 fordulat/percnél 15 perc alatt. A sejteket ezután újra szuszpendáljuk 100 ml TE tápközegben, amely 25% szacharózt és 5 mg/ml lizozimot is tartalmaz. 37 °C hőmérsékleten 1 órán ét végzett inkubálás után 50 ml 0,25 mól/liter EDTA oldatot (pH 8,0) adunk hozzá. 25 ml-es mintákat viszünk át 20%-os (súly/térf.) SDS (nátrium-dodecilszulfát) oldatot tartalmazó Sorvall csövekbe, és finoman keverjük szo5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
