197350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán relaxint kódoló gén molekuláris klónozására és jellemzésére, valamint humán H1 relaxin előállítására
12 197350 13 2. ) A hibridizációs vizsgálati minták (sertés DNS) előállítása Radioaktivan jelzőit vizsgálati mintákul készítünk primer-képző szintézissel különböző DNS fragmensekre, u borjú Limusz DNS denaturált véletlenszerű primer mintáit használva (3 vagy 4 bázis) [Taylor, J. M., Iliméi— see, R. és Summers, J.: Biochim. Diophys. Acta 442, 324-330 (1976)]. A sertés DNS templátot (100-200 ng) denaturáljuk ft véletlenszerű primer mintákkal együtt, 20 pl vízben forralva 2 percen át. A szintézist 30 pl reakciókeverék hozzáadásával indítjuk be, a reakciókeverék összetétele: 50 mmól/liter Tris-HCl (pH 8,0), 50 mmól/liter NaCl, 1 mmól/liter ditiotreitol (DTT), 10 mmól/liter MgClz, 5 egység E. coli DNS polimeráz 1, 500 pmól/1 dCTP, dGTP, dTTP mindegyikéből, és 0,3 mól/liter oC[32P]dATP-ből (kb. 3000 Ci/mmól, Amersham gyártmány). 37 C° hőmérsékleten 30 pei-cen át inkubálunk, majd a reakciót 300 pl pufferral történő hígítással leállítjuk; a puffer összetétele: 0,3 mól/liter NaCl, 10 mmól/liter Tris-HCl (pH 8,0), 1 mmól/liter EDTA. A keveréket Sephadex G- 50 oszlopon visszük át, ugyanazt a puffert, használva. A radioaktivan jelzett vizsgálati mintát összegyűjtjük a csúcsfrakciókból üres térfogatnál, és két térfogat elariollal kicsapjuk -20 C° hőmérsékleten, tRNS-t (10 pg) használva hordozóként. 3. ) Szűrővizsgálati eljárások Genom DNS fragmenseket tartalmazó lambda fágot növesztünk lágy agáron 105 fág/13 cm átmérőjű lemez mennyiségben, és nitrocellulóz szűrőkre visszük át (Schleicher és Schüll B A 85), amint ezt Benton és Davis leírták [Benton, W. D. és Davis, R.: Science 196, 180-183 (1977)]. A szűrőket hibridizáljuk radioaktivan jelzett vizsgálati mintákkal 40 C° hőmérsékleten 18 órán át módosított Denhardt oldatban [Denhardt, D. T.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 23, 641-646 (1966)], amely 5 x SSC-t és 25% formamidot tartalmaz. A szűrőket 2 x SSC-ben mossuk 30 C° hőmérsékleten 1 órán át, majd röntgensugár-filmre exponáljuk (Kodak XS-5) 24 órán át. A lemeznek azokat a területeit, amelyek pozitív hibridizációt mutatnak, újból tenyésztjük, és újból szűrővizsgálatnak vetjük alá többször is ismételve, amíg egyedi pozitív tarfoltokat tudunk szelektálni. A fágokat E. coli I DP 50 sup F sejtek 1 liternyi tenyészetének lízise után kinyerjük és a DNS-t Maniatis [Maniatis, T., Hardison, R. E., Lacy, E., Lauer, J., O'Connel, C., és Quon, D.: Cell, 15, 687-701 (1978)], valamint Yamamoto és Alberts által leirt módszerrel kipreparáljuk [Yamamoto, K. R. és Alberts, B. M.: Virology 40, 734-744 (1970)). 4.) DNS szekvencia analízis A kiválasztott rekombináns fág restrikciós fragmenseil közvetlenül az M 13 mp 8 fág Eco R 1, Pst 1, vagy Sma 1 helyeire szubklónozzuk. A kapcsolásokat 20 pl reakciókeverékben végezzük, a reakciókeverék 10 mmól/liter Tris-HCl-t (pH 8,0), 10 mmól/liter MgClî-t, 1 mmól/liter DDT-t, 1 mmól/liter ATP-t, 1 egység T4 DNS-ligázt, 100 ng DNS-t és az M 13 fág vektorból 50 ng-ol tartalmaz. 40 C° hőmérsékleten egy éjszakán át tartó inkubálás után a rekorabináns DNS-t E. coli JM 101 sejtekbe transzformáljuk [Sanger, F., Coulson, A. R. Barrel], B. G., Smith, A. J. A. és Rue, B. A.: J. Mól. Bioi. 143, 161-178 (1980)). A kódoló területeket tartalmazó tarfoltokat hasonló technikával szelektáljuk, amint ezt fentebb a genom szűrővizsgálatoknál leírtuk, azzal a különbséggel, hogy az M 13 fágot kisebb sűrűségben ( 103 fág/9 cm átmérőjű lemez) szélesztjük. A pozitív' tarfoltokat vagy egyszálú teniplát, va.’y replikálódó kettős szálú (rf) forma preparativ kitermelése érdekében növesztjük (lásd Sanger és munkatársai, fentebb idézett irodalom). Az egyszálú templétokat közvetlenül vetjük alá szekvencia-analízisnek [Sanger, F., Nicklon, S. és Coulson, A. R.: Proc. Nain. Acad. Soi. 74, 5463-5467 (1977)], mégpedig vagy Ml 3 fajlagos primer mintát (Collaborative Research) alkalmazva, vagy olyan szintetikus primereket alkalmazva, amelyek komplementerek a kódoló területen levő különböző szekvenciákra. A szubklónok teljes szekvencia analízisét az rf forma különböző helyeken, különböző restrikciós enzimekkel történő hasításával nyerjük, amelyet tompa végű [Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. A. és Roe, B. A.: J. Mól. Bioi. 143, 161-178 (1980)] vagy közvetlenül vég-jelzett fragmensekkel való kapcsolással történő szubklónozós, valamint a Maxam és Gilbert szerinti [Maxam, A. M. és Gilbert, N.: Proc. Natn. Acad. Sei. 74, 560-564 (1977)] szekvencia-analízis követ. A DNS szekvenciákat analizáljuk és komputer programok segítségével [Staden, R.: Nucl. Acids. Res. 6, 2601-2610 (1979)) összehasonlítjuk a sertés és patkány relaxin szekvenciákkal. B) EREDMÉNYEK Az itt következő tárgyalásban utalásokat teszünk az ábrákra. Az 1. ábra a genom kiónoknak egy rövidített restrikciós enzimtérképét mutatja. A méreteket kilo-bázispárban (kb) adjuk meg és a hasítási helyeket Eco R 1-nél (R), Pst 1-nél (P) és Hpa 11-nél (H) jellel jelöljük. A AH 5 genom klón egy Eco R 1 kapcso5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
