197209. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán retrovírus elleni, 3'-azido-3'-dezoxi-timidint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
16 197209 17 Az aktiv alkotórészt glicerinben és a steril viz nagyobb részében oldjuk. Ezután a nátrium-benzoát vizes oldatát, majd a szorbit-oldatot, és végül az izesitőanyagot hozzáadjuk. A térfogatot steril vízzel megfelelő térfogatra beállítjuk és jól összekeverjük. 6. példa (Szuppozitórium) mg/szuppozitórium aktiv alkotórész (63 /um)* 250 Hard Fat, BP (Witepsol H15 - Dynamit Nobel) 1770 2020 + Az aktív alkotórészt mint port használjuk, amelynek legalább 90%-a 63 um átmérőjű vagy ennél kisebb. A Witepsol H15 egyötöd részét egy kettősfalú, gözfütéses edényben, max. 45 C° hőmérsékleten megolvasztjuk. Az aktiv alkotórészt 200 jum-es szitán átszitáljuk, az olvadt anyaghoz hozzáadjuk, elkeverjük és aprítjuk, mig egyenletesen sima diszperziót nem kapunk. A keveréket 45 C° hőmérsékleten tartjuk, a maradék Witepsol H15-öt a szuszpenzióhoz adjuk és egyenletes homogén eleggyé elkeverjük. Az egész szuszpenziót egy 250 /um rozsdamentes acélszitán átengedjük és állandó keverés közben 40 C° hőmérsékletre hagyjuk lehűlni, majd 38-40 C° hőmérsékleten 2,02 g elegyet egy megfelelő műanyag öntőformába öntjük. A szuppozitóriumot szobahőmérsékletre hagyjuk lehűlni. 7. példa (Pesszárium) mg/pesszárium aktív alkotórész 63 /um 250 vízmentes dextróz 380 burgonyakeményitő 363 magnézium-sztearát 7 1000 Ezeket az alkotórészeket közvetlenül összekeverjük és a pesszariumot az elegy közvetlen préselésével kapjuk. Biológiai példák 1. példa Vírus-ellenes aktivitás (a) (i) Retrovirus-okozta ártalom BALB/c nőstény-egereknek, melyeket 1,5 x 104 mennyiségű Rauscher Murine Leu-10 kaemia Virus-sal (RVB3 törzs) fertőztünk, 3’-azido-3’-dezoxitimidint adagolunk. A kezelést a fertőzés után 4 órával 80 mg/kg intraperitóneális dózissal indítjuk és minden 8 órában azt, vagy orálisan, ivóvizben 0,5 mg/ml, vagy 1,0 mg/ml dózist adagolunk. Ilyen kezelésre azt találtuk, hogy a lép-sejt fertőzését és az ezt követő szplenomegália kifejlődését meggátolja, valamint a viremiát is elfojtja. (ii) 11TLV-I TM-11 sejtet (T-sejtklón HTLV-I fertőzésre érzékeny) besugárzott, HTLV-I termelő MJ-tumorsejttel együtt tenyésztjük a következő módon: (a) TM-11 sejt egyedül; (b) TM-11 sejt és MJ-tumorsejt; (c) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido--3’-dezoxitiinidin (3 /uM); (d) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido-3’-dezoxitimidin (9 mM); (e) TM-11 sejt, MJ-tumorsejt és 3’-azido-3’-dezoxitimidin (27 /uM). A 18. napon mindegyik tenyészetből a NDS-t extraháljuk és BamHl-el digeráljuk, hogy HTLV-I genóm fragments termeljen, mely bármely gazda-mellékszekvenciától mentes, és 3,3 kD standard molekulasúllyal rendelkezik. A digerálást ezután izotópjelzett lambda-MT-2-vel vizsgáljuk, mely egy standard próba a HTLV-I BamHl fragmensének felismerésére. Az (a)-nál hibridizáció nem figyelhető meg, mely a nem-fertőzött kontroliban a vírus hiányét jelzi. A (b)-nél a nem-kezeit, fertőzött kontrolinál erős jel látható. Gyenge jel vehető észre a (c)-nél, mely a vírus nem tökéletes megsemmisítését jelzi, és a (d)-nél, vagy (e)-nél hibridizáció nincs, mely a vírus teljes elpusztítását jelzi. Mindegyik tenyészet T-sejt receptor béta-lánc próbára is megvizsgáltuk. Mindegyik tenyészetnél erős jel van, mely kísérlet közben a TM-11 folytonos jelenlétét mutatja. (b) AIDV (i) Reverz larnszkriptáz aktivitás A 3’-azido-5’-trifoszfét-3’-dezoxitimidint in vitro AIDV transzkriptázzal (AIDV RT) teszteltük. Az AIDV RT-t pelletizált és extrahált AIDV-böl DEAE és foszfocellulóz oszlopokon eluélva tisztítottuk. Az enzimaktivitás 60 percen át lineáris és legalább két hónapig stabil, ha ml-ként 1 mg borjúszérum-albumint tartalmazó 60%-os glicerinben tároljuk. Template primer-ként rA-odT<i2-i8)-ot alkalmazva, az AIDV RT pH optimuma 7,0 - 7,3, MnClz optimuma 0,3 mM és MgCk optimuma 5 mM. Az aktivitás 5 mM MgCh jelenlétében 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
