197047. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok és az ezeket termelő gazdasejtek előállítására
47 197 047 48 majd egy éjszakán át rázzuk. Az dátumot iüü jal DE-52 (Whatman) Pasíeur-pipettában levő oszlopra engedjük, a dezoxi-ribonukleinsav adszorpciójára, Az oszlopot 2 ml hasonló összetételű puffénál mossuk, és a dezoxi-ribonuklelnsavat 400 pl alábbi összetételű oldattal eluáljuk- 15 M nátriumklorid, 50 mM trisz- (pH — 8,0) ás 1 mM etiléndiam i n-te t raecetsa v. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután 2 térfogat etanolban —20 “C hőmérsékleten, egy éjszakán át tárolva kicsapjuk. A csapadékot Eppendorf centrifugában centrifugálva összegyűjtjük. A 82 bázispárttól á!lő Hoc Íll-Hae íII dezoxi-ribonukieinsav-fmgmenst űjra oldjuk, és Sau 3A (Biolabs.) endonukleázzal emésztjük. 30 percen át 65 °C hőmérsékleten tartva az elegyet, inaktiváljuk az enzimet. Ezután 1 pg, 869 bázispárttól álló Hae m-Pst 1 dezoxi-ribonukleinsav-íragrrsenst adagolunk, és az oldathoz 10 mM magnézium-klorid, 10 mM ditio-treitol és 0,5 mM ATP végkoncentrációig adagolunk. 1 pl reakcióelegyre számítva 30 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal (Biolabs.) ligáinak. Az oldatot 10 órán át 15 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután fenollal és kloroformmal extrahálunk, majd az így kapott elegyet 2% agardzt tartalmazó gélen, trisz-borát - etilén - diamin - tetraecetsavban etidium-bromid jelenlétében frakcionáljuk. A Sau 3A-Pst 1 dezoxí-ribonukleinsav-fragraenst (lásd 9. ábra, 5. fragmens) az előzőekben megadottak szerűit extraháljuk, etanollal kicsapjuk és 10 pl következő összetételű elegybén oldjuk: 10 mM trisz-hidrogén-klorid (pH = 7,5) és 0,05 mM etilén-dia min-tetraecetsav. -b) A pBR 322 ß -laktanuiz íz abályozó szakaszát (ApPr) tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-fragmens előállítása A pBR 322 plazmidot Pst 1 (lásd 3b/ példa) hasítjuk, és 4 egység/'ml Bal 31 exonukleázzai (Bethesda Research Láb.) kezeljük, 4-10 percen át, 30 *C hőmérsékleten, a B-laktamázt meghatározó szegmens kihasítására. Az 5a) példában megadottak szerint eljárva, az alábbi szerkezetű kémiai dezoxi-ribonukleinsav-linkert szintetizáljuk: -5’-AT GTGT GATC ACACAT-3’. A linkért hozzákötjük a Bal 31 enzimmel kezelt pBR 322 dezoxi-ribonukieinsavhoz, ligálással. A kapott hibrid molekulát Bel I (Biolabs.) és EcoR I restrikciós endonukleázzal hasítjuk. Az emésztett termékeket 8% poliakdlamidot tartalmazó gélen frakcionáljuk trisz - borát - etilén - diamin - tetraecetsav jelenlétében, az előzőekben megadottak szerint eljárva (2a/ példában leírtak szerint). A 184 bázispárból és a 234 bázispárból álló marker dezoxi-ribonukleinsav között mozgó dezoxi-ríbonukleinsav-fragmenseket (ApPr dezoxi-ribonukíeinsavfragmensek) izoláljuk. Az izolálást a 7a) példában megadottak szerint végezzük. Az izolálás után etanollal ismert módon kicsapjuk a terméket. A csapadékot 10 mM trisz - hidrogén - kloridot (pH — 7,5) és 0,05 mM etilén - diamin - tetraecetsavat tartalmazó oldatban oldjuk. , c) Az ApPr dezoxi-ribonukleinsav-fragmens ligáldsa a cDNS szakaszhoz, és a CG-pBR 322(AP)/LylFN-<x-1 plazmid előállítása Az ApPr dezoxi-ribonukleinsav-fragmenseket és a cDNS -t tartalmazó oldatokat egyesítjük. Az oldat magnézium-klorid koncentrációját 10 mM-ra, dit o-treitol-koncentrációját 10 mM-ra és ATP-koncentrációját 0,5 mM-ra állítjuk be, majd 30 egység/pl T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal inkubálj ik, 12 órán át, 15 °C hőmérsékleten. Fenollal és kloroformmal extraháljuk az elegyet, majd 1 % alacsony olvadásponté aguróz. gélen frakcionáljuk. A kapott ApPr-cDNS fragmenst a Pst I és EcoR I enzimekkel hasított pBR 322 nagy fragmenséhez kötjük, az alábbiak szerint. Az ÁpPr-cDNS fragmenst tartalmazó géldarabot (körülbelül 20 pl) a I BR 322 Pst I-EcoR 1 fragmensével keverjük, két percen át 65 °C-on felolvasztjuk, 37 °C hőmérsékletre hűtjük az elegyet, majd ezután 0,5 mM ATP- t 10 mM ditio-treitolt és 10 mM magnézium-kloridot adagolunk. 12 órán át 15 "C hőmérsékleten T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal (Biolabs.) inkubálj ik az elegyet, amiután olyan oldatot kapunk, amelyben jelen van a CG-pBR (AP)/LylFN-cx-lrek nevezett rekombináns plazmid. d) Az E. coliHB 101 transzformálása a CG-pBR(AP)/LylFN-a-l plazmiddal A CG-pBR(AP)/LyIFN-<x-l plazmidot tartalmazó oldathoz ennek 1/10-ére számítva 100 mM ti isz-hídrogén-kloridot (pH — 7,5), 100 mM kalcium-kíoridot és 100 mM magnézium -kloridot tartalmazó oldatot adunk. Az egyesített oldatot 10 percen át 65 °C on tartjuk, a ligáz inaktiválására, majd 37 °C hőmérsékletre hűtjük. Ezután a 4. példában megadottak szerint eljárva, kalciumionokka! kezelt E. coli HB 101 sejteket transzformálunk, és a transzformált sejteket ml-enként 10 pg teíracik- Unt tartalmazó Mc Conkey-agarlemezekre széleszlj ik. A transzformált telepek interferon-aktivitását a 6. példában megadottak szerint meghatározzuk. A legnagyobb mennyiségű interferon-aktivitást produkáló kiónt szelektáljuk, és E. coli HB 101 OG-pBR(AP)/LyIFN-cc-l-nek nevezzük el. Az eredeti E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFNTb kíónhoz viszonyítva 1300-szoros termelésnövekedést figyeltünk meg; ez 40 000 nemzetközi egység/ ml aktivitásnak felel meg. . A CG-pBR(AP)/LyíFN-a-l klón rekombináns plazmid dezoxí-ribonukleinsavát a 3c) példában megadottak szerint izoláljuk a tenyészetből, és jellemezzük a beépített cDNS (interferon gén) nukleotid-szekvenciájának és a p-laktamáz szabályozó szakasz szekvenciájának meghatározásával. Az eredményeket a 10. ábrán adjuk meg. B) A CG-pBR(AP)/LylFN-o.-3 rekombináns plazmid előállítása Az E. coli HB 101 CC-pER 322/HLycIFN-8’, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25
