197046. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parazitaellenes hatású makrolid vegyületek, ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására és az ezeket tartalmazó növényvédőszerek
13 B tdpközeg g/1 D-glükóz Maláta-dextrin MD 30E 2,5 (Roquette Ltd. gyártmány) Arkasoy 50 (brit Arkady Co. 25,0 Ltd. gyártmánya) 12,5 Melasz 1,5 K^HPO., 0,125 CaC03 MOPS |3-(N-morfolino)-1,25 propán-szulfonsav] 21,0 Desztillált vízben 1 literre oldva, pH nátriumhidroxiddal (5n) autoklávozás előtt 6,5-re állítva. C tdpközeg g/1 D-glükóz Maláta-dextrin MD 30E 2,5 (Roquette Ltd. gyártmánya) 25,0 Arkasoy 50 12,5 Cukorrépa melasz 1,5 k2hpo4 0,125 CaC03 1,25 Silicone 1520 (Dow Corning) 0,625 Desztillált vízben 1 literre oldva, előtt 6,5-re állítva, pH sterilizálás 1. példa Streptomyces therrnoarchaensis NCIB 12015 spórákat a következő összetételű feide agarra oltoltunk: g/1 Élesztőkivonat (Oxoid L21) 0,5 Malátakivonat (Oxoid L39) 30,0 Mikológiái pepton (Oxoid L40) 5,0 Agár No. 3 (Oxoid L13) 15,0 Desztillált víz 1 literig, pH körülbelül 5,4. A tenyészeteket 28 °C-on 10 napig ínkubáltuk. Az érett tenyészeteket ezután 10%-os glicerinül - dattal fedtük be (6 ml), és egy steril eszközzel ledörzsöltük a spórákat és a micéliumokat a felületről. A kapott spóraszuszpenzióból 0,4 ml alikvotokat vettünk ki, és polipropilén csövecskékbe töltöttük, majd leolvasztottuk, és felhasználásig folyékony nitrogénben tároltuk. Egyetlen csövecske tartalmát használtuk fel azután 10 ml A tápközeg beoltásához, amelyet 3 napig 28 ”C-on inkubáitunk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. Ezt az inkubált tápközeget használtuk fel 15 cső és két 250 ml-es Erlenmeyer-lombik, amelyek 10, illetve 50 ml B tápközeget tartalmaztak, 2%-os beoltására. A csöveket és lombikokat 28 'C-on 5 napig tenyésztettük, és a tenyészeteket vákuumban leszűrtük, és a sejteket azonos térfogatú metanollal 30 percig kiráztuk. A Caenorhabdifis elegans-sza! szembeni aktiviíást mértük mind a csövekben, mind a lombikokban tenyésztett sejtek extraktumában, az extraktu,Ttokat összesítettük, szárazra pároltuk, és üjraextuháltuk 6 ml metanollal, a kapott oldatot Sephad- 3x LH20 oszlopra (110x2,5 cm) vittük fel, amelyet metanollal töltöttünk fel, és metanollal eluáltunk 10 ml es frakciókat gyűjtöttünk. A 21—28. frakciókat összesítettük, bepároltuk. és így 156 mg olajos maradékot kaptunk, amelyet CHQj-EA 3:1 térfogatarányú eleggyel extraháltunk, a kapott 3 ml extraktumot CCM oszlopra (55X2,5 cm) vittük fel. 10 ml frakciókat gyűjtöttünk, és tlc-vel, fluoreszcencia-indikátor használatával analizáltunk. A 20—23. és a 36—44. frakciók két nagyobb területet mutattak, ahol a fluoreszcencia kioltódott, és amelyeket 1 és U komponensként azonosítottunk (Rf értékek 0,70, ill. 0,43). A 20—23. frakciók bepárlásáva! az I komponenst kaptuk 9 mg szilárd termék formájában. 7TM, 238 nm, Ej 340; 245 nm, Ej 350; \t„ 254 nm E‘ 200. A 36—44. frakciók bepárlásáva! a II komponenst kaptunk 11 mg szilárd termék formájában. 238 nm, Ej 440; 245 nm, Ej 460; 254 nm, Ej 280, 14 2. példa Két 250 ml-es Erlenmeyer-lombikot, amelyek 50 ml A tápközeget tartalmaztak, beoltottunk 0,2 ml Streptomyces íhermoaichaensis NC1B 12015 spóra-szuszpenzidval, amelyet az 1. példa szerint áliftoltunk elő, és csövecskékben tároltunk. A lombikokat 28 °C-on 3 napig inkubáltuk egy 250 fordulat/perc, 50 mm átmérőjű mozgást biztosító rázógépen. A kapott tenyészetet használtuk fel egy 20 l es, 12 1 B tápközeget tartalmazó fermentor beoltására. A tenyésztést 5 nap múlva befejeztük, és a 3. példa szerinti módon dolgoztuk fel. 3. példa A 2. példában leírt módon, 28 °C-on 5 napig végzett tenyésztés után kapott 12 1 tenyészetet lecentrifugáltuk (4200 ford/perc, 10 "C on, 15 percig). A sejttömeget 5 1 metanollal kevertük, és 20 óra hosszat 4 °C-on állni hagytuk. A micélium-extraktumot leszűrtük, 40 °C-on bepároltuk, és 100 ml bután-l-ol hozzáadásával azeotrópos desztillációnak vetettük alá. Az extraktumot ezután 5-szöt 200 ml metanollal kezeltük, és a kombinált extrakíumokat 100 ml-re bepároltuk, és egy Sephadex L.H2Ü oszlopra (112X5 cm) vittük fel. Az eluálást metanollal végeztük, 200 ml előeluátum után 50 ml-es frakciókat gyűjtöttünk. A 40—90. frakciókat összesítettük, és bepároltuk, így 3,85 g olajos maradékot kaptunk, amelyet 77 ml CHClj-EA 3:1 térfogatarányű eleggyel extraháltunk. Az extraktu-197046 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
