197044. lajstromszámú szabadalom • Eljárás streptomyces és E.coli sejtekben használható kimer klónozó vektorok előállítására
27 197 044 28 leeuíar and General Genetics. 162, 30 (1978)], a lemezekre előzőleg a transzformációhoz eredetileg használt Streptornyces griseofuscus spórákat juttatünk; annyit, hogy sejtréteget kapjunk kinövést követően. Ezt az eljárást elvégezhetjük YMX-agarral is, ennek összetétele a következő: 0,5% élesztőkivonat 0,5% malátakivonat 0,1% dextróz 2,0% agar. A transzformánsokat 3 napon át, 30 °C hőmérsékleten való inkubálás után figyelhetjük meg oly módon. hogy megszámláljuk az úgynevezett pockokat. A pock-okban plazmidot tartalmazó spórák helyezkednek el. A. transzformánsokat a pock középpontjából tű segítségével izoláljuk, és YMX- táptalajra szélesztjük [Hopwood, Bacteriological Review, 31, (1967)]. 2) E. coli KI2 C600Rk— Mk— sejtekbe való újratranszformálás: A spórákat az 1) pontban megadottak szerint gyűjtjük össze, és 0,4% glicinne! kiegészített, 50 m! térfogatú TSB táptalajt inokulálunk. A tenyészeteket 20 órán át 30'C hőmérsékleten növesztjük, majd a sejteket összegyűjtjük, és izoláljuk a dezoxiribonukieinsavat. Az izolálást az 1B) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a cézium-kloridos centrifugálást propidiumjodid jelenlétében kihagyjuk. Ezután 50 pl dezoxiribonukleinsav-készítménnyel a 7B) példában megadottak szerint eljárva E. coli KI2 C600Rk—Mk— sejteket transzformálunk. A transzformánsokban jelenlévő plazmidot a 11. példában megadottak szerint eljárva azonosítjuk. 18. példa A Streptornyces griseofuscus tpJL 114, a Streptornyces griseofuscus/pJL 121, a Streptornyces griseofuscus/pJL 125, a Streptornyces griseofuscus/plL180 és a Streptornyces griseofuscus/pJL181 előállítása A törzsekkel egyenként a 17. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pJL120 plazmid helyett a pJL114, pJL12í, pJL125, pJL180, illetve a pJL181 plazmidot használjuk. 19. példa A Streptornyces griseofuscus/pJL190 előállítása A) Transzformálás A transzformálást a 17B) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL120 plazmid helyett a pJL190 jelű plazmidot használjuk. B) Szelektálás A transzformánsokat neonácin rezisztenciára szelektáljuk, oly módon, hogy a regenerálódó protoplaszíokat 1 pg/nú végkoncentrációt kialakító, megfelelő mennyiségű neomicint tartalmazó R2 táptalajjal rétegezzük felül. A kapott Streptornyces griseoíuscus/pJL190 transzformánsokat a 17C(2) példában megadottak szerint eljárva a várt pock morfológiára vizsgáljuk. 20. példa A Streptornyces griseofuscus!pJLl 95 előállítása A kísérletet a 19. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL190 plazmid helyett a pJL195 jelű plazmidot használjuk. 21. példa A Streptornyces griseofuscus/plL192 előállítása A kísérletet a 20) példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pJL192 plazmidot használjuk, és a szelektáláskor nem 1 pg/ml neonácin végkoncentrációt kialakító, har.em 10 pg/ml neonácin végkoncentrációt biztosító agaira! rétegezőnk. 22. példa A Streptornyces fradiae/pJLl20, a Streptornyces f -adiae/pJL 121, a Streptornyces fradiae/pJL125, a Streptornyces fradiae/pJL180, a Streptornyces fradiae/pJL181, a Streptornyces fradiae/pJL!90, a Streptornyces fradiae/pJLl 95 és a Streptornyces fradiae/pJLl 92 előállítása A kísérletet a 18., 19., 20. és 21. példákban megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a Streptornyces griseofuscus helyett a Streptomyces fradiae-t használjuk. Ezenkívül a protopiasztoláshoz és növesztéshez a Streptornyces fradiae esetén a TSB táptalajt úgy módosítjuk, hogy a;, csak 0,2% glicinl tartalmazzon. 23. példa A Streptornyces lividans/plL120, a Streptornyces lividans/pJL121, a Streptornyces Hvidans/plLl25, a Streptornyces lividans/plL180, a Streptornyces íividans/pJL181, a Streptornyces lividans/pJLl 90, a Streptornyces lividans/plL195 és a Streptornyces lividans/plL192 előállítása A kísérletet a 18., 19., 20. és 21. példákban megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a Streptornyces griseofuscus helyett a Streptomyces lividans-t használjuk. Ezenkívül a Strep-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 50 65 15
