197043. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS-t tartalmazó gazdasejtek stabilizálására és szelekciójára

13

197043

14

használva [Itakura és munkatársai (1977), Science, különböző oligo-dez.oxi-ribonukleotidokat az I.

198, 1056 és Crea és munkatársai (1978)]. A táblázatban mutatjuk be.

7. táblázat

A timozin-a-i génhez használt szintetikus oligonukleotidok

Vegyület

Szekvencia

Hosszúság

Retenciós idő a HPLC analíziskor (perc)*

Tj

A-A-T-T-C-A-T-G-T-C

10

17,4

t2

T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A

15

24,3

t3

T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A

12

20,3

t4

G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A

13

22,0

t5

G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G

15

24,8

t6

G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A

12

20,1

t7

A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A

13

22,6

t8

A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T

12

20,2

t9

G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G

12

20,4

T,o

A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-r

12

21,1

T„

g-t-c-g-a-a-g-a-g-g-c-t

12

20,5

t12

G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G

12

20,4

T„

C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T

12

19,9

t14

T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C

12

20,5

T1S

G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C

12

20,2

Tw

G-A-T-C-C-T-A-T-T-A

10

17,2

* = szobahőmérsékleten.

A fenti szintézist T,s fragmens előállításával szemléltetjük a mellékelt 8. ábrán. A T,s szintézisekor használt különböző nukleotid fragraenseket az ábrán számokkal jelöljük. A rövidítések a következő jelentésűek:

TPSTe: 2,4,6 - tri - izopropil - benzol - szulfonil- tetrazol;

BSA: benzol-szulfonsav;

TLC: vékonyréteg-kromatográfia;

HPLC: nagy felbontású folyadékkromatográfia;

DMT: 4,4’-dimetoxi-tritil-csoport;

CE: 2-ciano-etil-csoport;

R: p-klór-fenil-csoport;

Bz: benzoilcsoport;

An: anizoil-csoport;

iBu: izobutirilcsoport;

Py: piridin;

AcOH: ecetsav;

EtjN: trietil-amin. 85

85 mg (0,05 mmól) 4 és 180 mg (0,1 mmól) 2 teljesen védett tridezoxi-ribonukleotidot az 5’hidroxilcsoportokon hasítunk, és ezzel eltávolítjuk a védőcsoportokat. A reakciót úgy végezzük, hogy a vejyületeket 10 percen át 0 °C hőmérsékleten tartjuk, kloroform és metanol 7:3 térfogatarányú elegyének 20 ml-ében és 10 ml, 2%-os bcnzolszulfonsavban. A reakció leállítására telített, vizes ammónium-bikarbonátot adagolunk 2 ml oldatban, majd 25 ml kloroformmal extraháljuk az elegyet, és

35 végül kétszer 10 ml vízzel mossuk. A szerves oldószeres fázisokat magnézium-szulfáttal vfzmcntcsftjük, körülbelül 5 ml térfogatra töményítjük, és petroléter (35 °C—60 °C-os frakció) adagolásával kicsapjuk. A színtelen csapadékot centrifugálással 43 összegyűjtjük, és vákuum-szárítóban csökkentett nyomású térben szárítjuk, amiután megkapjuk a 6 és 8 termékeket. A termék a szilikagél vékonyré teg-kromatográfiás vizsgálat (Merck 60 F254, kloroform és metanol 9:1 arányú elegye) vizsgálatok 45 szerint homogén.

Az 1 és 3 trimerek 270 mg-nyi (0,15 mmól), illetve 145 mg-nyi (0,075 mmól) mennyiségét az 5, illetve 7 foszfc-diészterekké alakítunk oly módon, hogy 10 ml alábbi összetételű elegyben kezeljük 25 cg percen át, szobahőmérsékleten:

trietil-amin, piridin ás víz 1:3:1 arányú elegye.

A reagenseket rotavaporban eltávolítjuk, és a desztillációs maradékot háromszor 10 ml vízmentes piridinnel való desztillációval vízmentesítjük. 0,05 55 mmól 8 trimert és 7 trimert 50 mg (0,15 mmól)

2,4,6 - tri izopropil - benzol - szulfonil - tetrazollal egyesítünk 3 ml vízmentes piridinben, és a reakcióelegyet csökkentett nyomású térben hagyjuk állni 2 órán át, szobahőmérsékleten. A vékonyréteg-kro(50 matográfiás vizsgálatok szerint a 8 trimer 95%-a hexameter termékké alakult (ezt úgy muztatjuk ki, hogy n 4,4’ - dimetoxi - tritil - cst»|x>rtot 10%-os, vizes kénsavai reagáltatjuk, és 60 *C hőmérsékleten hevítjük a bepermetezett kromatogramot). A reak*35 ciót 1,0 ml víz adagolásával állítjuk le, és az oldó8