197042. lajstromszámú szabadalom • Eljárás állati eredetű sejtek tenyésztésére
G 197 042 10 nck az eredményeit az !. ábra a) grafikonja szemlélteti, amelyen a fekete körök jelzik a csíraképes sejtpopuláció sűrűségének és az üres körök az antitesltitcrénck változásait az idő függvényében. A maximális csíraképes sejtszám 6,4 volt (log», csíraképes sejt/ml), majd ezután gyorsan csökkent. Az antitesttjter alacsony volt és a sejtpopuláció sűrűségének csúcsértéke után lényegileg már nem növekedett. Úgy látszott, hogy a tenyésztés csökkenő fázisa egybeesik a glutamin kimerülésével a táptalajból. Ezért vizsgálatokat végeztünk tápanyaggal egyszerűen adalékolt szakaszos tenyészetekkel, amelyeknél a tenyészethez kiegészítésképpn glutamint adtunk. Második összehasonlító kísérlet Tápanyaggal egyszerűen adalékolt szakaszos tenyészet NBI hibridoma sejteket tenyésztettünk szusz penzióban, magzati borjűszérumnuil kiegészített DMEM táptalajban, mint az első összehasonlító ki sérletben. A tenyészethez a tenyésztés késői exponenciális fázisában egyetlen adagban glutamint adtunk (4 mM végső hozzáadott koncentrációig). Az így kapott eredményeket az 1. ábra b) grafikonja szemlélteti. A glutamin hozzáadása lényegében nem befolyásolta a sejtpopuláció sűrűségének (fekete körök) a maximumát, de a tenyészet hoszszabb időtartamon át csfraképes maradt, ami az összes antitesttiter (üres körök) növekedését eredményezte. Vizsgálatokat végeztünk továbbá oly módon, hogy egyetlen adag helyett a glutamin ismételt dózisait adtuk a tenyészethez. Az így kapott eredményeket az 1. ábra c) grafikonja szemlélteti. Ha a glutamin ismételt (négyszer) dózisait adtuk a te nyészethez, alkalmanként 1 mM/liter koncentrációban 40 órás időtartam al.att, akkor a sejt- vagy antitesthozam nem javult althoz viszonyítva, amikor 4 mM glutamint egyszerre vittünk be. Ez kitűnik, ha az 1. c) ábrát az J. b) ábrával összehasonlítjuk. A nyilak mindegyik ábrán a giutaminadagolás időpontját jelzik. Ezért megvizsgáltuk a tenyészet felülúszóját egy 5 glutaminadagolásos tenyésztésnél, így az 1. b) ábra szerintinél, és azt találtuk, hogy más kulcstápanyagok is jelentősen kimerültek. Úgy mutatkozott, hogy a glükóz, amely energiaforrás és más biomolekulák prekurzora is, a iriss 10 táptalajban levő koncentrációjának körülbelül 1%ára csökkent. Hasonlóképpen azt találtuk, hogy a DMEM táptalaj valamennyi aminosav-komponense eredeti koncentrációjának 10—15%-ára csökkent. Ezért úgy gondoltuk, hogy a táptalajnak 15 ezeket a komponenseit pótoljuk, egyszeri adagolást és szívatásos betáplálást alkalmazva, s így a tenyésztés ideje alatt valamennyi tápanyagot feleslegben tartjuk. A kiegészítő tápanyagba kolint, egy sejtmembrán-prekurzort is kevertünk. 20 Kísérlet 25 Tápanyaggal adalékolt szakaszos tenyészel Vizsgáltunk egy tápanyag-beadagolási rendszert, NBI sejteket tenyésztetve 5 literes levegőztetett fermentorban, 3 lé riogat % magzati borjúszérumma! 30 kiegészített DMEM táptalajban. A kezdeti sejtpopuláció-sűrűség körülbelül 0,2 X106 csíraképes sejt/ml volt. Amikor a sejtek szaporodása elérte a körülbelül 1X106 csíraképes sejt/ml populációs sűrűséget, a kiegészítő tápanyagok egy adagját a te-35 nyészethez adtuk, és a szívatásos adagolást megindítottuk. A kiegészítő tápanyagok kvantitatív összetételéhez a tápanyag-felhasználásnak azokat a mintáit vettük alapul, amelyeket a glutaminnal kiegészített tenyészetek analízise alapján kaptunk 40 [lásd 1. b) grafikon]. A tápanyagok összetételét és a tenyészethez való adagolás módját az 1. táblázatban foglaljuk össze. A kapott eredményeket az 1. c„) grafikon szemlélteti. 45 /. ’(fbUizat Komponens Adagolás mg/liter tenyészet Az adagolás módja „A” adalék L-glutamin 250-350 egyetlen adag mint 200 mM óidat, amikor a sejtszám 1 X106 sejt/ml „B” adalék L-cisztin L-ílrozin L-triptofán 10-10 40-70 10-20 egyetlen adag mint vizes szuszpenzió, amikor a sejtszám IX10* sejt/ml „C" adalék L-Iizin-I ÍCi L-hisztídin L-arginin-HCl L-glicin 100— 140 30-40 60—30 10-30 szívatással betáplálva mint koncentrált oldat, foszfáttal pufícrolt sóoldatban. A betáplálást akkor kezdjük, amikor a sejtszüm lx 10* sejt/ml és körülbelül 50 órán át végezzük 6
