197011. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új imidazo- és triazolo-1,4-benzodiazepinek előállítására
7 jük, és acitrát-vért 150 g-vel (1200 fordulat/perc) 20 percen át centrifugáljuk. A vérlemczkék nggregációját a Born és Cross által kidolgozott eljárással mérjük, [G. V. R. Bőm és M. J. Cross, J. Physiol. 168, 178 (1963)], amely szerint a vérlemezkékben dús plazmához állandó keverés közben PAF-ot adunk aggregációt kiváltó szer gyanánt. A vizsgálati anyagot ezt megelőzően, 2—3 perccel korábban, 10 pl térfogatban adjuk a plazmához. Oldószerként desztillált vizet, etanolt és/vagy dimetil-szulfoxidot használunk. A kontroll kísérletnek ugyanazt az oldószert kell megfelelő mennyiségben tartalmaznia. Miután regisztráltuk a kiindulási abszorpciós értéket (2—3 perc), PAF hozzáadásával (5 X 10~s M) indukálj uk az aggregációt. A vegyületek hatásának megítélésére az első aggregációs csúcs maximuma alkalmas. A PAF által indukált maximális abszorpciósráta értékét (maximális aggregáció X 100%) minden meghatározásnál összehasonlítjuk az egyidejűleg végzett vakkísérlet értékével ( kétcsatornás aggregométer egyik csatornája a vizsgálati anyag, a másik a kontroll részére szolgál), amelyet 100%-nak veszünk. A vizsgálati anyag hatására megváltozott aggregáció értékét százalékban fejezzük ki. Minden vizsgálati anyagnak 10-3 és 10~8 M koncentrációtartományban, szúrópróbaszerűen, 4 párhuzamos kísérletben méljük a PAF által kiváltott vérlemezke-aggregációra kifejtett gátló hatását. Ezután legalább három koncentrációnál mért érték alapján megszerkesztjük a koncentráció-hatás görbét és leolvassuk az 1C50 (50%-os gátlást okozó koncentráció) értéket. Az (la), illetve (1b) általános képletű vegyületek ICjo értéke általában nem éri el a 9 pM-t. 2. In vivo vizsgálatok 2.1. A PA F által ki váltott hörgőösszehúzó hatás antagonizálása altatott tengerimalacokon Spontán lélegző, hím, 300—450 g tömegű tengerimalacokat orálisan kezelünk a vizsgálati anyaggal, illetve vehikulummal 1 órával a PAF intravénás infúzióját [30 ng/(kgXperc)] megelőzően. Az állatokat ezután 2 mg/kg intraperitoneálisan adott metánnal elaltatjuk és kanült vezetünk a véna jugularisba, az artéria carotisba és a légcsőbe. A kontroll állatok a PAF infúzióra erős és tartós hörgőösszehúzódással reagálnak, amelyet a légzési térfogat, valamint az áteresztőképesség és ellenállás alapján, a vérnyomás csökkenésével együtt, mérünk. Mintegy 7-10 perc múlva áll be a halál. A PAF-antagonisták ezeket a légzésre, illetve vérnyomásra gyakorolt hatásokat, valamint az elhullást kivédik. 2.2. A PAF által kiváltott vérnyomáscsökkenés antagonizálása altatott patkányokon Normotóniás, hím, 200—250 g tömegű Wistar patkányokat 2 mg/kg intraperitoneálisan adott metánnal altatunk és kanült vezetünk a véna juguiarisba, valamint az artéria carotisba. A kontroliállatoknál az intravénás PAF infúzió [30 ng/ (kgXperc)] erős és tartós vémyomáscsökkenést okoz, amit a leírt vegyületek intravénásán beadva ké|X\sck dózisfüggő mődon (kumulatív adagolás) felfüggeszteni. Az intravénás PAF-infúzió megindítása előtt orálisan, vagy intravénásán adott hatóanyag is képes a PAF vérnyomáscsökkentő hatását gátolni. 2.3 A PAF által kiváltott bőrduzzanat antagonizálása patkányokon [Módosított eljárás, P. P. Koelzer és K. H. Wehr, Arzneim.—Forsch. 8, 181, 1958)] PAF intrakután injekciója bőrduzzanatot okoz, ami egyik megnyilvánulása az erek megnövekedett permeabilitásának. Hím, 25ü±2ü g tömegű wistar patkányok hasi oldalán a szőrzetet leborotváljuk és az állatok farokvénájába 1 ml/kg 1%-os tripánkén-oldatot fecskendezünk. A középvonalra szimmetrikusan, három, egymástól mintegy 1,5 cm távolságra levő helyre fiziológiás konyhasó-oldatot, illetve PAF-oldatot (dózisonként 12,5—15 ng 0,1 ml térfogatban) fecskendezünk a bőrbe. A konyhasó helyén nem észlelünk elváltozást, míg a PAF-befecskendezés helyén a dózistól függő intenzitással kékre színeződött duzzanat látható. A tárgyalt vegyületek egyidejű intrakután dózisa, vagy intravénás előkezelés megakadályozza a PAF által indukált bőrreakció kifejlődését. 1 8 3. Központi idegrendszerre gyakorolt hatások Általánosan ismertek az 1,4-benzodiazepinek központi idegrendszerre gyakorolt hatásai, amelyek azonban a PAF-antagonista vegyületeknél nem kívánatosak. Ezért megvizsgáltuk a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek altató, görcsgátló és motoros aktivitást befolyásoló hatását. Az esetleges altató hatást 400—450 g tömegű tengerimalacokon tanulmányoztuk. Ezen az állatfajon a vegyületek 200 mg/kg-ig tetjedő orális dózisai semmiféle kimutatható altató vagy szedatfv hatást nem okoznak. A görcsgátló hatás megállapításához 20—25 g tömegű egereken a pentetrazol-antagonizmust vizsgáltuk [M. I. Gluckmann, Current Therapeutic Research, 7, 721, (1965)]. A vegyületek 100 mg/kgig terjedő orális dózisa (1 órával a pentetrazol beadása előtt) semmiféle befolyást nem gyakorolt ezen a teszten a pentetrazol (125 mg/kg, L p. LD 100) által okozott mortalitásra. A spontán motoros aktivitás vizsgálatát 20—25 g tömegű egereken, fotocellás motiméterben végeztük, amelyben a fénysugár megszakításainak számát számoljuk. A tárgyalt vegyületek 300 mg/kgig terjedő orális dózisai nem befolyásolták a spontán motoros aktivitást. Az alábbi táblázat tartalmazza a PAF-antagonizáló hatás vizsgálata során, valamint a Flunitrazepam-receptorkötési teszten (FNB) mért értékeket néhány ismert, illetve a találmány szerinti eljárással előállított vegyület esetében. 197 01 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
