196915. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére kromatográfiás úton
17 196 915 18 Humán szérum szétválasztása (optikai sűrűség 280 nm-en) 7. táblázat Frakció száma O.D. Frakció száma O.D. Frakció száma O.D. 1 0,0017 13 0,052 25 0,06 2 1,3 14 0,061 26 0,026 3 1,3 15 0,102 27 0,008 4 1,3 16 28 0,004 5 0,554 17 0,187 29 0,011 6 0,262 18 0,355 30 0,003 7 0,135 19 0,379 31 0,008 8 0,082 20 0,361 32 0,015 9 0,067 21 0,313 33 0,016 10 0,064 22 0,233 34 0,011 11 0,055 23 0,156 35 0,005 12 0,052 24 0,098 36 0,006 Amint az a 7. táblázat eredményeiből látható, a dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiával kapott szétválasztás a szétválasztott humán szérum hagyományos képét mutatja két főcsúccsal (IgG, albuminok). A szétválasztás rövid idő alatt végbement. 9. példa Ebben a példában a dinamikus-oszlopos folyadékkromatográfiát affinitás-kromatográfiához alkalmaztuk nyúl IgG izolálására, ligandumként SEP1IAROSE-4B (védjegyzctt Pharmacia gyártmány) — antitestet használva. Az antitest kecskében termelt anti nyúl szérum. SEPHAROSE-4B-antitest: az antitestet a SEPHAROSE-4B adszorbenshez (védjcgyzctt Pharmacia gyártmány) kapcsoljuk, Axel Porath és munkatársai: Nature, 214 (1967) instrukciói szerint 1 g SEPHAROSE-4B 50% 30 mg kecske-anti nyúl szérum kötés Dinamikus oszlop: 6 mm belső átmérőjű üvegoszlop, töltve SEPHAROSE-4B antitesttel. Kimutatás: Közvetlenül az oszlopról, mérőcellával, 280 nm-en mért UV adszorpcióval. Puffer: 1. Foszfát-puffcr/NaCL, pH -7,8 2. Glikokoll/HCl (0,1 M), pH=2,5 Az eljárás során a következő műveleteket végeztük: 1. A SEPHAROSE-4B-t kapcsoltuk a kccskcanti nyúl szérumhoz. 2. A dinamikus oszlopba töltöttünk 3 ml SEPHAROSE-4B antitest gélt, mindkét oldalon VYON (védjegyzett) szűrőrendszer (körülbelül 40 (im-cs) közé zárva. 3. A töltött oszlopot 6 ml 1. puíl'erral mostuk. 4. Az oszlopra vittünk 0,5 ml normál nyúl szérumot. 5. 37 °C-on 2 órán át inkubáltuk az oszlopot. 6. Az oszlopot az 1. puffernd eluálluk, és frakciókat szedtünk, amíg a fotométer 0,1 alatti optikai sűrűséget mutatott. 7. Az oszlopot a 2. puffernd (pH = 2,5) eluáltuk, és frakciókat szedtünk, amíg az optikai sűrűség 0,1 -nél kisebb lett. A példa szerinti affinitás-kromatográfia eredményét grafikusan a 13. ábra szemlélteti. A találmány szerinti eljárás igen pontos és a hagyományos kromatográliával összehasonlítva, az alábbi előnyei vannak: a) a hagyományos kromatográfia gravitációs áramlásával ellentétben a mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiában kifejezetten nyomást fejtünk ki az adszorbens ágyra, ami a komponensek jobb elválasztását teszi lehetővé; b) az eljárás igen gyors, ami a rendszerben alkalmazott belső nyomásnak is következménye, c) az eljáráshoz kevesebb eluens szükséges, mint a hagyományos kromatográfiához, d) a mozgóágyas kromatográfiás rendszerben a belső nyomás alkalmazása lehetővé teszi, hogy kisebb szemcsenagyságú adszorbenst használjunk, mint a hagyományos kromatográfiában; ez nagyobb érzékenységet eredményez. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás oldatban lévő egy vagy több komponens elkülönítésére mozgó-oszlopos folyadékkromatográfiás úton — az oldat szétválasztandó komponenseinek legalább egy szilárd adszorbenssel töltött, ellentétes végein be-, illetve kivezetéssel ellátott, mozgatható kromatografáló oszlop adszorbenságyán való adszorbeáltatásával; — a kromatografáló oszlop bevezetésének adott mennyiségű eluenssel töltött, csőszerűén kialakított, az oszloppal alakosan illeszkedő és azt befogadó tartályba való helyezésével és — a kromatografáló oszlopnak a tartályban lévő eluensen át való elmozgatásával, azzal jellemezve, hogy az eluenst a csőszerű tartályban létrejövő belső nyomás révén az adszorbenságyon keresztül kényszentjük, és az oszlopról így eluált, legalább egy elválasztott komponenst a kromatografáló oszlop kivezetésén elvezetjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy két adszorbenságyat használunk, és a másik adszorbensággyal a bevezetett oldatot koncentráljuk. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eluenst a tartályba vezetjük, mielőtt a tartály alját lezárva, az oszlopot lefelé kényszerítve a tartályba toljuk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a szétválasztandó komponenseket az osz-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
