196846. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a humán gamma-interferon biológiailag aktív származékainak és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előllítására
2 A korábban már közzétett hmnán-7-interferon aminosav szekvenciája — a továbbiakban IFN-7-146 aminosawal rendelkezik (Devos és mtársai, NuCl. Acids. Res. 10,(1982)2487). Egy kérőbbi közzététel szerint azonban (Rinderknecht és mtársai., J, Bioi. Chem. 259 (1984) 6790) a korábban már publikált szekvenciából az érett IFN-7 első három aminosavja hiányzik. A továbbiakban az aminosav számozásakor a Devos és mtársai. szerinti szekvenciát követjük. A 146 944 számú európai szabadalmi bejelentésből ismert az IFN-7 származékainak géntechnológiai előállítása. Az előállításban a 9-es helyzetben lévő Lys-t Gln-nel helyettesítik. Ezenkívül egyéb módosításokat is végeznek. Az egyik ilyen módosítás az N-terminális 4 illetve 7 aminosawal történő rövidítése, amelyet a DNS Bal 31- felemésztésével és expreszszióval végeznek, Ezek az IFN-7 származékok a természetes lFN-7-hoz hasonló vagy nagyobb aktivitásűak. Javasolták (3 414 831 számú, NSZK-beli közrebocsátási irat) olyan lFN-7-származékok előállítását, amelyeknél a természetes szekvencia első négy aminosavja kiesik anélkül, hogy így az IFN-7 biológiai aktivitása számottevően megváltozna, és/vagy a 127 aminosav utáni (Alanin) aminosavat eltávolítanák és így ugyancsak biológiailag aktív termékeket állítanak elő. Felismertük, hogy biológiailag aktív lFN-7-t állíthatunk elő, ha a természetes szekvencia 5-ös helyzetében lévő (Asp) aminosavat lehasítjuk. Találmányunk tárgya olyan IFN-7-részszekvenciák előállítására irányuló eljárás, amelyeknek aminosav szekvenciája a 6-os helyzettel (Pro) kezdődik és a 146-os (Gin) helyzetig, de legalább a 127 helyzetig (Alá) terjed. Felismértük továbbá, hogy a találmány szerinti eljárással rövidített IFN-7 részszekvenciákat különösen előnyösen az Asp-Pro-kötések savas hasításával (Piszkoewicz és munkatársai, Biochemical and Biophysical Research Communications 40 (1970) 1173) és renaturálásával állíthatjuk elő. Meglepő módon ilyen drasztikus körülmények között is biológiailag aktív IFN-7-származékot állíthatunk elő, és ez annál meglepőbb volt, mivel az IFN-7 savas közegben labilis vegyület (például 88 540 számú európai szabadalmi bejelentés, 5. oldal, 33-36. sor). Ebben az eljárásban kiindulási anyagként az összes olyan polipeptidet alkalmazhatjuk, amelyek a természetes IFN-7-nak megfelelően az 5-ös helyzetben aszparaginsavat, és a 6-os helyzetben prolint tartalmaznak. Ezt a hasítást előnyösen olyan fúziós proteinekkel végezzük, amelyek a természetes vagy átalakított IFN-7-szekvencia aszparaginsavja előtt és adott esetben egyéb aminosav előtt lévő N-termlnális egy például bakteriális protein viszonylag hosszú aminosav-szekvenicájához kötődik. Az Asp-Pro aminosav sorrendű polipeptid savas hasítása nem szorítkozik csak a természetes IFN-7-ra, hanem ugyanúgy használható az összes lFN-7-aminosav sorrendű polipeptid. Ezeknek a polipeptideknek rendkívül savstabilaicnak kell lenniük, azért, hogy a keletkezett hasítási termékek, vagy adott esetben csak a kívánt hasítási termék — ne vagy ne irreverzibilisen alakuljon át. Az eljárási feltételek természetesen a hasítási termékek, illetve a kívánt hasítási termék savstabilitásához igazodik és célszerűen egyszerű előkísérletekkel határozzuk meg. Savként előnyösen alkalmazhatunk 7 *» hangyasavat, sósavat, vagy egyéb, hasonlóan nem oxidálódó savat, így például hígított kénsavat, foszforsavat, halogénezett ecetsavat vagy szulfonsavat, Mivel a reakciót vizes közegben folytatjuk le, ezért a reakció hőmérsékletét körülbelül 0-120 °C hőmérséklet között végezzük. Alalcsonyabb hőmérsékleten az eljárás kíméletesebben megy végbe, de ez hosszabb időt igényel. A forráspont körüli hőmérséklet bár rövidebb időt igényel, azonban csak rendkívül stabil termékeknél használható. Ezért az előnyös hőmérsékleti tartomány 10-70 °C, különösen 20-60 °C. A vizes közeg savkoncentrációja a termék érzékenységéhez és a sav erősségéhez igazodik. Előnyösen hangyasavat alkalmazunk, amelynek koncentrációja vizes közegben 70-80 tömeg%. A hasítási eljárást homogén vagy heterogén fázisban végezhetjük. A viszonylag kis molekulájú proteineket célszerűen vizes sav oldatban feloldjuk, vagy először szuszpendáijuk, illetve részben oldjuk, ezt követően az eljárásban többé-kevésbé teljes feloldódás végbemegy. A specifikus savas hasítás befejeztével a reakcióelegyet célszerűen semlegesítjük, ezt előnyösen hűtés közben végezzük, majd a kívánt terméket Ismert módon elválasztjuk és renaturáljuk. Az elegyhez például adhatunk megfelelő adszorpciós anyagot, és a telített abszorbensből a kívánt terméket eluáthatjuk. Ezt követően vagy az előzőekben leírtintézkedések helyett a terméket egy vagy több kicsapásl művelettel tisztíthatjuk. A kívánt peptidet specifikus antitesttel terhelt oszlopon is izolálhatjuk. A találmány szerinti eljárással rövidített IFN-7- -részszekvenciákat és a biológiailag aktív analógokat előnyösen géntechnológiai úton állítjuk elő. Ekkor egy gazdaszervezetben, előnyösen az E. coli ban egy gén exprimálódik, amely a találmány szerinti aminosav-szekvenciát kódolja. Ezt a gént ismert eljárással szintetizálhatjuk, vagy gének átalakításával előállíthatjuk. Erre példák a következő irodalmi helyek: 77670, 88 540„89 676, 95 350, 146 453, 146 944 vagy 155 590 számú európai szabadalmi iratok, illetve 3 414 835 számú NSZK-beli közzétételi irat. Ha a találmány szerinti IFN-7-származékok géntechnológiai szintézise a 3 409 966 számú NSZK- beli közzétételi irat, illetve a 155 590 számú európai szabadalmi iratban közölt eljárás szerinti történik, akkor a szintetikus génben az IFN-7 -szekvencia első 5 aminosayjára vonatkozó kódok kiesnek. A gén szintézisben így például a (II) DNS-szekvenciában az Ia-Id egységek helyén a következő ligonukleotidokat alkalmazhatjuk: MET Pro Tyr Val Lys Glu Alá 5’ AA TTC ATG CCG TAC GTT AAA GAA GCT 3’ (Eco RI) G TAC GGC ATG CAA TTT CTT CG A Glu Asn (Leu) (Lys) ~ - 5’ GAA AAC 3f 3’ CTT TTG GAC TTT 5’ A géntechnológiai szintézist elvégezhetjük a 3 414 831 számú NSZK-beli közzétételi irat alapján is (161 504 európai közzétételi irat). Ebben a bejelentésben felsorolnak több olyan módosított DNS-szekvencia variációt, amelyből a megváltozott aminosavszekvenclájú IFN-7-anaIóghoz lehet jutni. A szintetikus géneket természetesen génkonstruk196.846 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80 *■ -H
