196844. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligomicin-komplex és komponensei előállítására fermentációs úton
1 2 196.844 b) Oligomicin-komplexet tartalmazó fermentlevek előállítása kísérleti fermentorban: A/, a) lépésben ismertetett izolált és vizsgált Streptomyccs diastatochromogenes var. RO-31 törzzsé} (MNG 00366) az alábbi összetételű, 750 ml térfogatú Frlenmeyer lombikban sterilezett, 250 ml csapvízzel készített táptalajt oltjuk be (a táptalaj jele; III): Mogyoróliszt 1% Hidrolizált kazein(10%-os) 1% Nétrium-klorid 0,45% Kalcium-karbonát 0,5% Glükóz (50%-os oldatban külön sterilezve) 1,5% A táptalaj pH-ját nátrium-hidroxid oldattal 6,8- 7,0-re állítjuk, majd autoklávban 121 °C hőmérsékleten 30 percig sterilizáljuk. A tenyésztést síkrázógépen 28 °C-on 48 órán át végezzük. Az így elkészített oltóanyag mikroszkópi képén dús, fonalas telepképződési növekedést figyelhetünk meg. Az így kapott oltóképes tenyészet 250 ml-ével 7,5 liter össztérfogatú laboratóriumi kísérleti fermentorban 121 C hőmérsékleten 60 percig sterilezett 5 liter, az alábbiakban megadott összetételű táptalajt (jele: IV) oltunk: Mogyoróliszt 1% Hidrolizált kazein (10%-os) 1% Nátrium-klorid 0 45% Kalcium-karbonát 0,5% Glükóz (50%-os oldatban külön sterilezve) 4,5% Poli(propilén-glikol) 0,4% A táptalaj pH-ját sterilezés előtt nátrium-hidroxid oldattal 6,8 7,0-re állaítjuk be. 28 °C-on, 400 fordulat/perc sebességű keveréssel, 7,5 literfperc sebességű levegőztetéssel 120 órás fermentációt végzünk. Fzután az oligomicin-termeiést biológiai értékméréssel, Aspergillus niger tesztorganizmussal határozzuk meg. Eredmény: 960 pglml. Az oligomicin-tartalmútenyész.léből centrifugálással választjuk el a mikroorganizmus sejtjeit. A felülúszó gyakorlatilag nem tartalmaz hatóanyagot, így elönthető. A nedves micéliumot (tömege icb. 800-1000 g) csapvízzel többször alaposan átmossuk (a mosáshoz szükséges víz mennyisége 5 liter fermentlé esetén kb. 22 - 25 liter), majd vízsugár-vákuumban szűrjük. Ezután a nedves micéliumot ismert módon, körülbelül 1 órás intenzív keverés közben 500 ml acetonnal extraháljuk, majd egy éjszakán át állni hagyjuk. Ezután a micéliumot leszűrjük, és célszerűen még legalább két alkalommal 500 -500 ml acetonnal ismételten extraháljuk. Az acetonos extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson 40 °C-on vizes maradékig bepároljuk. A vizes maradékot négyszer 300 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, 1% aktív szénnel kezeljük és nátrium-szulfáton szárítjuk, a vizes maradékot pedig elöntjük. A derítőszenet és a nátrium-szulfátot kiszűrjük, a szűrlctet csökkentett nyomáson 40 °C-on szirupsűrűségre bepároljuk, majd 5 ml dietil-éterből 300 ml hexánnal kristályosítjuk az anyagot. A kivált kristályokat éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, ezután szűrjük, és kevés hexánnál átmossuk. Ilyen módon 5 liter fermentléből 2,9-3,1 g, 95%-os tisztaságú kristályos oligomicin komplexet kapunk, amelynek összetétele (nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 szerint) a következő: Oligomicin-A 70—75% Oligomicin-B 10-15% Oligomicin-C 10-15% Az össztétel fermentációnként kissé változhat. c) Az oligomicin komplex egyedi komponenseinek elválasztása: Az oligomicin komplex egyedi komponenseit Nasamune és munkatársai módszerével (J. Am. Chem. Soc. 80, 6092 /1958/), kromatografálással választjuk el. Oszloptöltetként 2 kg Hyflo supercel-t használunk. 13,2 liter n-hexán,4,8 liter dioxán, 1,5 liter abszolút etanol és 1,7 liter desztillált víz elegyét választótölcsérben alaposan összerázzuk, majd 2 óra állás után az alsó (vizes) fázist elöntjük. A felső fázis körülbelül 2 liter részletét összekeverjük az oszloptöltettel, ezután a töltetet kromatografáló oszlopba töltjük. Az oszlopra 7,1 g oligomicin komplexet viszünk fel, és az oszlopot a felső fázis maradékával, 250 ml/10 perc sebességgel eluáljuk. Az eluátumokat 250 ml tér forgató frakciókba gyűjtjük, és az egyes frakciókat vé konyrétegkromatográflásan elemezzük. Az oligomi cin-C a 21—30. frakcióban az oligomicin-A a 35—55 frakcióban, míg az 1—20., 31—34., 58—60. és 118 120. frakció nem tartalmaz antibiotikumot. Az azonos komponenseket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az egyesített frakciókból bepárlással elkülönítjük az egyedi oligomicin komponenseket. A következő termékeket kapjuk: Oligomicin-A: [a]23TM_ 54,2° (c = 4,4%, dioxánban, irodalmi érték: -5ah5°). A termék nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint homogén, és megegyezik a hiteles mintával (Sigma standarddal). Oligomicin-B: [°]2 n ro-46,5° (c = 0,76%, dioxánban, irodalmi érték: -46,5°). A termék nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint homogén, és megegyezik a hiteles mintával (Sigma standarddal). Oligomicin-C: [a]2yy= -80,4° (c = 3,7%, dioxánban, irodalmi érték: -8uj7°). A termék nagynyomású folyadékkromatográfiás vizsgálat szerint homogén, és megegyezik a hiteles mintával (Sigma standardddal). d) Foszfát-tartalmú táptalajon fenntartott Strepto-, myces diastatochromogenes var. RO-31 termelőképességének stabilitási vizsgálata: Az a) pontban ismertetett eljárással készült ferde agar tenyészeteket +4 °C-on tároljuk, majd kéthavonta egy-egy ferde agárról készült oltóanyaggal beoltjuk a b) pontban leírt eljárás szerint kísérleti fermentorban készült táptalajt. A b) pontban megadottak szerint tenyésztünk, és az oligomicin komplexet a b) pontban leírt módon különítjük el. Az eredményeket a III. táblázatban közöljük. IIE táblázat A tárolás ideje (hónap) 0 2 4 6 8 Kitermelés g/fermen tor 3,05 2,80 3,12 . 3,08 ________ 3,10 Az a) pontban ismertetett eljárással előállított ferde agar tenyészeteket +4 °C-on tároljuk, és havonként egyszer az a) pontban megadott összetételű fenntartó táptalajra átoltjuk.7 napos inkubálás után elvégezzük 4
