196843. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-lizin előállítására
1 2 196.843 A jelen találmány tárgya eljárás L-lizin előállítására, amelynek lényege az, hogy a dihidrodipikolinsav szintnz fa továbbiakban DDPS) vagy a tetrahidropikolinsav s/ukciniláz (a továbbkakban THPS) szintézisében érintett gént tartalmazó DNS fragmens rekombináns DNS-ét és egy vektor DNS-t beépítünk a Corynebacterium vagy Brevibaeteriuin nemzetséghez tartozó valamelyik mikroorganizmusba, a mikroorganizmust valamilyen táptalajon tenyésztjük, és a fermentlében felhalmozódó L-lizint kinyerjük. Így a jelen találmány a biológiai ipar területére vonatkozik, és főként az L-lizin előállításának területére, amely takarmányadalékként használatos az iparszerü állattenyésztésben. Az úgynevezett glutaminsav-termelő mikroorganizmusok, például a Corybaterium és Brevibaeteriuin nemzetségek mikroorganizmusainak rekombináns DNS technológia útján való tökéletesítését az L-lizin-termelés javítása céljából a 160997/81 és 126789/83 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentésekben közölték. Nagymennyiségű L-lizin mikroorganizmusok alkalmazásával való termelésére szolgáló eljárás tökéletesítése olyan probléma, amely bármely időben megoldandó, és a feltalálók eddig tanulmányozták a probléma megoldását a rekombináns DNS technológia hatékonyabb felhasználásával. A feltalálók felfedezték, hogy az L-lizin termelőképessége javítható vagy olyair'lörzs alkalmazásával, amely az. L-lizin bioszintéziséért felelős, a DDPS vagy THPS szintézisében érintett gén rekombinánsát és egy vektor plazmidot tartalmaz. A jelen találmány tárgya egy L-lizin előállítására szolgáló eljárás, amelynek alapja az, hogy a DDPS vagy THPS szintézisében érdekelt gént tartalmazó DNS fragmens rekombináns DNS-ét és egy vektort DNS-t viszünk be egy Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmusba, a mikroorganizmust valamilyen táptalajban tenyésztjük, és a fermentlében felhalmozódó L-lizint kinyerjük. A mellékletként szereplő 1. ábra a PDC18 vektor piamid előállításának folyamatát mutatja be, ahol Spc/Sm a spektinomicin és streptomicin rczisztencia-markercket mutatja Ap az ampicillin rezisztenciamarkert és Tea tetraciklin reziszlenciamarkert. A jelen találmány szerint L-lizin a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetségéhez tartozó valamely olyan mikroorganizmusnak valamilyen táptalajban való tenyésztése útján állítható elő, amely a DDPS vagy THPS szintézisében érintett gént tartalmazó DNS fragmens rekombináns DNS-ét és egy vektoi DNS-t tartalmaz, az L-lizin felhasznozódik a fermentlében és az L-lizin nyerhető ki. A Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó mikroorganizmus gazdaszervezetként az úgynevezett glutáminsavtermelŐ mikroorganizmusokként ismert mikroorganizmusok bármelyike használható. Előnyösen a következő törzsek használhatók: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium harculis ATCC 13868 Corynebacterium liJiuni ATCC 15990 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacterium flavum ATCC 14067 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Brevibacterium immariophilium ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Használhatók mikroorganizmus gazdaszervezetként lizintermelőképességgel nem rendelkező vad törzsek, de használhatók lízín-termelőképességgel rendelkező törzsek is. Uzintermelő törzsként ismert törzsek, például aminosavígényes mutáns törzsek, aminosavanalóg-rezisztens mutáns törzsek stb. alkalmazhatók. A DDPS vagy THPS szintézisében érintett génként eukariotákból, prokariotákból, vírusokból, bakteriofágokból vagy plazmidokból származó bármely ilyen gén használható. A prokariota baktériumokhoz, például az Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus vagy Serratia nemzetséghez tartozó valamely törzsnek a génje előnyös. Különösen előnyös ezekhez a baktériumokhoz tartozó valamely lizinterniclő-mutáns törzsből származó gén. A gént tartalmazó DNS fragmens befogadására szolgáló vektorként előnyösen a feltalálók által kifejlesztett pCGl, pCG2, pCG4, pCGll, pCE54, pCB101 stb. használatos. Ezen vektorok előállítására szolgáló eljárásokat a 134500/82, 1383799/82 35197/ 83 és 105999/83 számú nyilvánosságra hozott hapán szabadalmi bejelentésekben írnak le. A DDPS vagy THPS szintézisében érintett gént tartalmazó DNS fragmens rekombináns DNS-e és a vektor DNS a rekombináns DNS technológia szerint nyerhetők, amelynek lényege, hogy mindkét DNS-t in vitro hasítjuk restrikciós endonukleázokkal, az elhasított DNS-cket DNS ligázzal rekombináljuk, a ligációs eleggyel transzformálunk egy mutáns törzset, amely a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozik és génhiányos, a transzformált sejteket szelektáljuk, és a defektiv fenotípust helyreállítjuk. A rekombináns DNS-technológia a 186492/ 82 és 186489/82 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentésekben leírt eljárások szerint hajtható végre. A rekombináns DNS közvetlenül a Cerynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó valamely mikroogranizmusban való klónozás helyett úgy is kapható, hogy más alaposan tanulmányozott gazdavektor rendszert, például Escherichia coli rendszert használunk. Azaz a gént tartalmazó klónozott DNS fragmensek a transzformált mutánsokból nyerhetők azzal a módszerrel, amelyre az jellemző, hogy olyan Escherichia coli mutánst, amelyből hiányzik a DDPS vagy THPS szintézisében érintett gén, transzformálunk a donor DNS és a vektor DNS in vitro ligációs elegyével, és szelektáljuk azokat a transzformált mutánsokat, amelyekben a génhiányos fenotípus helyreállítódott. A DNS-nek a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó valamelyik baktérium vektor DNS-ével in vitro történő rekombinálásával transzformáljuk a Corynebacterium vagy Brevibacterium nemzetséghez tartozó baktériumot, és lehetővé válik, hogy olyan baktériumunk legyen, amely tartalmazza a gént tartalmazó klónozottrekombináns DNS-t. A jelen találmányt az alábbiakban részleteiben ismertetjük, főként a Corynebacterium glutamicumnak a DDPS szintézisében érintett (a továbbiakban DDPS génnek vagy dapA-nak nevezett) génjére és a Cotyne-2
