196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 nidin-hidrogén-kloridra számítva), 0,5 térfogat etanolban oldott 1M ecelsav oldattal kicsapjuk a csapadékot legalább három órán át -20 C hőmérsékleten tartjuk a szuszpenziót, majd centrifugáljuk. A csapadékot guanidin-hidrogén-kloridban szuszpendáljuk és fentieket megismételve újra kicsapjuk. Az ismételten kivált csapadékot percenként 6000-szer forduló rotorban 5 percen át centrifugáljuk, majd ezután mindent steril körülmények között végzünk. A végső csapadékot szobahőmérsékleten etanolban diszpergáljuk, a fölös guanidin-hidrogén-klorid eltávolítására extraháljuk, majd 5 percen át 6000 fordulattal centrifugáljuk. Az etanolt nitrogénáramban desztilláljuk és az RNS üledéket erőteljes rázás közben vízben oldjuk. 10 percen át 10 °C hőmérsékleten 13 000 percenkénti fordulatszám mellett centrifugálunk, az RNS-t tartalmazó felülúszót dekantáijuk. Az RNS-teljes extrakciójára kétszer 0,5 ml steril vízzel újra extraháljuk az oldhatatlan anyagot, az extraktumot 10 percen át 10 °C hőmérsékleten percenkénti 130 000 fordulatszámú rotorban centrifugáljuk és egyesítjük a vizes oldatokat. Ezt 0,1 térfogat pH5-ös, 2 mólos kálium-acetát/ecetsav pufferral és 2 térfogat etanollal keverjük, és egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Centrifugálással elkülönítjük az RNS-t az etanolos szuszpenzióból, a centrifugálást 20 000 fordulat/perc fordulatszámú rotorban végezzük 20 percen át -10 C hőmérsékleten, Corex csövekben (HB4 rotor). A csapadékot 95%-os etanollal erőteljesen mossuk, nitrogénáramban szárítjuk, és 1 ml/g sejt mennyiségű, 10 mM trjsz-puffert, pH 7,5, ImM EDTA-t és 0,2% SDS- t tartalmazó elegyben oldjuk. Az RNS oldódása után 1/9 térfogat 5 mólos nátrium-kloridot adagolunk és az oldatot oligo-(dT)-oszIopra (0,5 g száraz súly, T3 grade, Collaborative Research) öntjük. Az oszlopot az alábbi összetételű eleggyel erőteljesen mossuk, 0,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz, ImM EDTA, pH 7,5, 0,2% SDS, majd a mosás után 10 mM trisz, 1 mM EDTA, pH 7,5 és 0,05% SDS eleggyel eluáljuk. Az eluációt X 260-on hullámhosszon ellenőrizzük. Az UV-elnyelő frakciókat összegyűjtjük és ecetsav-nátrium-acetát, pH 5, puffer és 2,5 térfogat etanol adagolá sával kicsapjuk. A szárított üledéket 50jul/l térfogat 10 mM trisz, pH 7,5, I mM EDTA elegyben oldjuk és 9 térfogat dimetil-szulfoxidot adagolunk, majd közvetlenül ezután 1 térfogat pufferezett 1 mólos lítium-klorid oldatot (I M lítium-klorid, 50 mM EDTA, 2,0% SDS, 10 mM trisz, pH 6,5). Az oldatot 5 percen át 55 C hőmérsékleten tartjuk, 100 térfogat kötő puffert adagolunk hozzá, majd oligo-dT-cellulóz oszlopra öntjük, amit kötő pufferral (0,5 M nátrium-klorid 10 mM trisz, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) egyensúlyoztuk ki. Az eluálást az előzőkben megadottak szerint végezzük. A monoklónozott immunglobulin polipeptidek könnyű és nehéz láncait meghatározó mRNS jelenlétét hibrid szelekcióval bizonyítjuk, a megfelelő nehéz és könnyű láncokat leíró gének (lásd Early és Hood, Genetic Engineering, 3. kötet, 1981, Setlow és Hollander, Plenum Publishing Corp., 157-188. oldal) DNS klónjait használva. A DNS próbákat a közölt aminosav- vagy DNS-szekvenciák alapján szintézissel állítjuk elő, vagy más forrásból nyerjük (lásd Early és Hood, mint fent). A DNS próbákat denaturáljuk, semlegesítjük és nitrocellulóz szűrőpapírhoz kötjük. (Schleicher és Schnell BA-85-R 597) a Southern féle módszert használva (J. Mól. Bioi., 98, 503-517,1975). \ kísérletet 10-szer tömény standard citráttal végezzük (lásd még a 4 302 204 számú amerikai egyesült íllamokbeli leírást). A próbákat 30 /rg mRNS-hez hibidizáljuk 100 /il végtérfogatú reakcióelegyben 50 °C hőmérsékleten, 2 órán át. A reakcióelegy összetétele: 65% formamid/10 mM puffer, pH 6,4, 0,4 M nátriumklorid. 10 másodpercig microfugában centrifugáljuk a reakcióelegyet, vortexeljük, ismét centrifugáljuk, majd gyengén vortexeljük a szűrőpapírok szuszpendá!ására. 1 órán át gyenge keverés közben 50 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet. Ezután az oldatot eltávolítjuk, a szűrőket tízszer 1 ml alábbi összetételű eleggyel mossuk: 0,15 M nátrium-klorid, 0,15 m nátrium-citrát, 0,5% nátrium-dodexilszulfát. A mosópuffer hőmérsékletét 60 °C-on tartjuk. A mosófolyadékok adagolása közben több másodpercen át vortexeljük a csöveket. Ezután kétszer 10 mM trisz, pH 7,8 és 2 mM EDTA elegyének 1 ml-vel mossuk a szűrőket, majd 5 percen át 60 °C hőmérsékleten inkubáljuk, és levegőztetéssel eltávolítjuk az oldatot. Az RNS-DNS hibridről az RNS-t úgy eluáljuk, hogy a szűrőket 60 másodpercen át 300 ul kétszer desztillált, steril vízben forraljuk, majd metanol-száraz jég fürdőben gyorsan fagyasztjuk. Jégen felolvasztjuk az oldatot, az RNS-t tartalmazó vizet egy másik csőbe juttatjuk, 0,2 M végkoncentrációban nátrium-acetátot adagolunk és 20 fig borjú thymus tRNS-t adagolunk. 2,5 térfogat etanollal -20 °C hőmérsékleten kicsapjuk az RNS-t és közvetlenül transzláció előtt 12 000 g-n 10 percig, 4 C hőmérsékleten centrifugálva üllepítj ik. Az üledéket kétszer 70%-os etanollal mossuk, majd csökkentett nyomáson szárítjuk. Az eluált RNS-t in vitro transzlatáljuk nyúl retikulocita sejtmentes lizátumban, például a New England Nuclear transzlációs rendszert használva, amuitán a rendszerhez adott melléklet szerint detektáljuk a protein szintézist. Monoklónozott antitestekkel alikvot mintákat inkubálunk, úgy, hogy az in vitro transzlációs lizátumban lévő kifejeződő termék feleslegben legyen jelen. Az antitest-antigén komplexet rögzített S. aureus-szal kicsapjuk és háromszor pH 8,3,0,05 M triszt,0,45 M nátrium-kloridot és 0,5% NP40-t tartalmazó eleggyel mossuk a csapadékot, 0,01 mólos nátrium-foszfát pufferben (pH 7,5) forraljuk, a pufferhez előzőleg 1% ßmerkapto-etanolt adunk. A mosás után 5-20%-os g adiens SDS-poliakril-amid gélen elektroforézist végzünk 125 V feszültségen, mindaddig, míg a brómfenrlkék jel eléri a gél végét és plusz I órát. Szárítjuk a gélt, fixáljuk és az immunoglobulin könnyű és nehéz láncait meghatározó mRNS kimutatására Kodak X-R filmet használva fotózzuk, Az így kapott mRNS keverékkel Okayama és Berg műszerét (Molecular and Cellular Biology, 1982 február, 161-170. oldal) használva kétszálú cDNS sorozatot állítunk elő. Először megadjuk a vektor primer és az oligo-dG-t tartalmazó linker DNS előállításának módját. 400 /rg pBR322-SV40 (térképegység 0,71-0,86) DNS-t az alábbi összetételű, 0,4 ml térfogatú reakcióelegyben, 37 °C hőmérsékleten 700 egység Kpnl endonukleázzal kezelünk: 5 mM trisz-hidrogén-klorid, pH 7,5, 6 mM magnézium-klorid, 6 mM nátrium-klorid, 6 mM 2-merkapto-etanol és 0,1 mg/ml marha szérum albumin (BSA). 5 órás kezelést követően 40 ;ul 196.84: 5 10 15 20 25 30 35 . 40 45 50 55 60 10
