196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 és a változó szakaszt meghatározó kódoló szekvenciát tartalmazó szakaszt hordozó transzformánsok izolálására. A szokszorosításra számtalan, baktériumban létező vektor molekula áll rendelkezésünkre, például a pBR322, pSCIOl, pRK290, 2 p plazmid stb. A kohézív végekkel rendelkező rövidebb fragmens vektorhoz kötése után olyan hibrid plazmídot kapunk, amely a DNS oligomer által kialakult heteroduplex-et kivéve, ahol a DNS-szekvenciák hibásak, komplementer DNS-szekvenciákat tartalmaz. A hibás szekvenciákat tartalmazó hibrid plazmid a gazdasejtben replíkálódik, amikor két különböző plazmid molekula jön létre, az egyik az eredeti szekvenciája, a másik pedig a szintetikus DNS oligomer jelenléte miatt tailored (hasított) vagy site mutated (helyileg mutált). A transzformáns telepeket külön-külön 2 ml térfogatú tenyészetekben növesztjük, a plazmid DNS-t ismert módszerekkel izoláljuk és felhasználjuk egy második t transzformációs ciklusban a hasított szekvenciát replikáid kiónok előállítására. A kiónokat szűrő folthibridizációval választjuk ki, vagy jelzett szintetikus DNS oligonukleotiddal (például szintetikus DNS oligomert használunk a változó szakasz szekvenicájának váltpztatására) vizsgáljuk, vagy más előnyös módszerrel. Így olyan plazmidokat kapunk, amelyek kétszálú cDNS-e megfelelő restrikciós helyeket tartalmaz és előre meghatározott helyen stop kondonnai rendelkeznek. Mégha tározót t a kódoló szál 3 -terminális vége (a C-terminális aminosavat írja le), majd meghatározottá válik a kódoló szál 5 -szakasza (ez a polipeptid N-terminális részét határozza meg). A két vég módosításának sorrendjét kényelmi szempontok határozzák meg, módosítható a két vég egyszerre, ekkor a kódoló szál 5-végén primer repaírt, a 3-végen pedig helyi mutációt végzünk. Attól függően, hogy az a gazdasejt, ahol a kifejezés megtörténik, milyen természetű, és attól függően, hogy a gazdasejt mechanizmusa éltávolítja-e a vezető szekvenciát, miután a polipeptid szekretálását elősegítő szekretáló szignálként felismert, különböző stratégiát alkalmazunk. Ha a gazdasejt nem képes a fentiekre, úgy a vezető szekvenciát meghatározó DNS sza kaszt el kell távoiítanunk és létre kell hoznunk a változó szakaszt meghatározó kódoló szál 5 -végén egy start kodont. Azután a rövidített szekvenciát kifejeződő vektorba építhetjük, mégpedig úgy, hogy egy előre meghatározott promoter és riboszomális starthely szabályozása alá kerüljön. A vezető szekvencia szekvenciájára vagy a változó szakasz N-terminális részét meghatározó szekvenciára alapozva különböző homo- vagy heteroduplex képző oligonukleotidokat állíthatunk elő. Ha a vezető szekvencia megmarad, a kódoló szál 5 -eltérő szekvenicájának eltávolítására primer repaírt használunk. Ha az N-terminális primer repair a C-terminális mutagenezissel együtt történik, az oligonukleotiddal duplex kódoló szálat DNS polimerázzal kezeljük és a kapott részlegesen kétszálú DNS-t 5 -3 -egyszálú exonukleázzal kezeljük Az 5-eltérő szakaszok eltávolítására, majd ligázzal kezelve hozzákötjük a replikálódó szálat az N-terminális oligonukleotidhoz. Ha eltávolítjuk a vezető szekvenciát, in vitro mutagenezisscl alakítjuk ki a változó szakaszt meghatározó DNS-szekvencia N-terminális részén az iniciációs kodont (ATG az N-formil-metionin esetén). Az előnyös kétszálú cDNS izolálására in vitro mutagenezis végzésére többféle módon járhatunk el. Ha a kódoló szekvenciától távoleső restrikciós helyek léteznek, a plazmidot a megfelelő restrikciós endo; ukleázzal emésztjük, majd az emésztést kétszálú DNS-t hasító exonukleázzal, például Ba131-eI folytatjuk. A kapott kétszálú cDNS klónozható és a megfelelő szekvencia szelektálható és módosítható, ahogy azt a fentiekben megadtuk. Ha a kódoló szál 5’ végén lévő nenf kódoló szakasz túl hosszú, ez endonukleázzal emészthető, ha megfelelő restrikciós hely létezik, de végezhető az emésztés exonukleázzal is, például Bal31 -el. A fenti, a 3 -terminális vég módosítására használt eljárást megismételve a változó szakaszokat meghatározó DNS szekvencia 5 -terminális vége hasítható, jelen esetben az oligonukleotid komplementer a nem kódoló (nonsense) szállal, és az 5 -végen (pirmer repair) vagy az oligonukleotidban (in vitro mutagenezis) iniciációs kodont tartalmaz. Közönséges körülmények között is az oligonukleotid homoduplexet printer répámhoz, a (jteroduplexeket in vitro mutagenezisre használjuk. így olyan hasított készálú cDNS-t kapunk, amely az immunglobulinok könnyű és nehéz láncainak változó szakaszát meghatározó, alkalmasan elhelyezkedő start és stop kodonokat tartalmaz. A kapott tompa végű kétszálú cDNS módosítható, például úgy, hogy linkereket kötünk hozzá kifejezhető vektorba való beépítést megengedő komplementer végek előállítására. A beépítés úgy történik, hogy a vektor megfelelő orientációban tartalmazza a beépített szakaszt a kétszálú cDNS-hez kapcsolt vagy a vektorban jelenlévő szabályozó szignálhoz képest. Az előállított kétszálú cDNS-t kifejező vektroba építjük. A korábbi vektorokkal ellentétben, mivel ezek csak a kétszálú cDNS replikációját tették lehetővé, a jelen kísérleti stádiumban használt molekulának tartalmaznia kell a transzkripciós és transzlációs szabályozójeleket. A megfelelő promotert és más transzkripciós szabályozó szignál-szekvenciákat, például operátort, attenuatort, aktivátort, tartalmazó vektort választunk. A vektort legalább részben szekvenálnunk kell ahhoz, hogy legalább egy beépülési helyet meghatározhassunk, ahova a változó régiókat meghatározó cDNS-t a szabályozó jelek kontrollja alá építhetjük be. A transzkripciós szabályozó jelek mellett léteznek, ahogy azt már közöltük, transzlációs szabályozó jelek is, elsősorban a riboszóma kötőhely (Shine-Dalgarne-szekvencia, S-D) és az iniciációs kodon (formil-met kodon). Az S-D szekvenciának és az iniciációs kodonnak megfelelően kell elhelyezkednie, általában 3—12 bázispár távolságban. Az S-D szekvencia a vektorba egy beépülési helyhez képest megfelelő pozícióban lehet, de hozzá is kapcsolható a változó szakaszt meghatározó kódoló szevenciához, például az S-D-szekvenciát biztosító oligonukleotid lizálásával és egy megfelelő restrikciós hely létrehozásával az S-D-szekvenciát követően. Az S-D-szekvencia in vitro mutagenezissel is kialakítható, ahogy azt az előzőekben már megadtuk, A kódoló szekvencia leolvasási fázisban kell hogy legyen az iniciációs kodonnal. A választott stratégia attól függ, hogy a kódoló szekvencia és az ezen kívüleső régiók tartalmaznak-e vagy sem restrikciós helyeket. Függ attól, hogy milyen vektor áll rendelkezésünkre a kétszálú cDNS-szekvencia beépítésére és a polipeptid változó szaka196.842 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
