196842. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hibrid DNS és az ezet tartalmazó kötő készítmények előállítására
1 2 A DNS-szekvencia és a restrikciós térkép alapján megállapítható, hogy PstI helyek találhatók a kódoló szál -110, bázispárja mellett és a könnyű láncot meghatározó cDNS terminációs helyétől lefelé haladva, ugyanakkor felhasználható HindUI restrikciós helyek helyezkednek el a nehéz láncot meghatározó szál vezető szekvenciájától felfelé és terminációs kodontól lefelé haladva. A könnyű és nehéz lánc változó régióit meghatározó kódoló szál és a vezető szekvenciák nem tartalmaznak a fenti endonukleázok által felismerhető helyet. Az izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat a gyártó utasításai szerint a megfelelő restrikciós endonukleázokkal emésztjük és a kapott fragmenseket 2%-os agaróz gélen (Seakem, 15 cm x 15 cmx0,2 cm) 100 V feszültségkülönbséggel 2 órán át elektroforézissel tisztítjuk, Kontrollokat használva megállapítjuk az egyes csíkok molekulasúlyát és kivágjuk a gélből. A gélcsíkokat 1,5 ml-es Eppendorf-csövekbe helyezzük, gyorsan fagyasztjuk száraz jég-alkoholos fürdőben, majd kétszer felolvasztjuk. Ezután percenként 15000- et forduló Eppendorf centrifugában centrifugáljuk és a felülúszót elkülönítjük. A DNS denaturálására 6xSSC-ben forraljuk a felülúszót, amikor egyszálú DNS-t kapunk. Ezt 0 °C-ra hűtjük. 196.842 A DNS-szekvencia alapján olyan DNS-oligomert készítünk, amely legalább részben komplementer a 5 könnyű és nehéz lánc változó szakaszinak megfelelő nem kódoló (antisense) száljainak rövid szakaszaival. Az oligomer az 5’-végen iniciációs kodont tartalmaz (ATC, az N-formil-metioninhoz (f-met)) továbbá komplementer a primer repair vezető szekvenciáját - meghatározó N-terminális nukleotidjaival, vagy olyan végekkel rendelkezik, amelyek f-met kodont tartalmaznak és komplementer szekvenciákat a vezető szakasz kódoló szekvenciájának 3’-végére és a változó régiók kódoló szekvenciájának 5.’-végére in vitro mutagenezis végrehajtása céljából. Az oiigomert könnyen 1 c előállíthatjuk Itakura és munkatársai módszerével (j. Bioi. Chem., 150,4592,1975). Az alábbiakban ismertetjük a könnyű és nehéz láncokra alkalmazható primer repair szintézis szkémáját, ahol a vezető szekvenciát megtartjuk a, illetve b. és azt az in vitro mutagenezis módszert, amelynek során 20 a vezető szekvenciát eltávolítjuk és a könnyű és nehéz lánc változó szakaszát leíró kódoló szekvencia N-terminális végébe f-met kodont építünk be (a, illetve d). A hosszú vonalak hosszú DNS láncokat, a rövid gondolatjelek a beépített végeket jelentik. 25 3’ 5’ 3’ ATG GAC TAC CTG ATG AGG GCTTAC TCC GCA 3’ 5’ 1) Denaturálás (a szálak elkülönítése) 2) 5’ - ATG GAC ATG AGG GC - 3* ATG GAC ATG AGG GC TAC CTG TAC TCC GC---------5’ Klenow-fragmens + dNTP-k (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) ATG AGG GC TAC TCC GC TTG TGG — AAC ACC — 3* 5’ 3’ 5’ 1) Denaturálás 2) 5’-ATC TTG TGG AAG TTG TGG AAC ACCL __ ''- JClenow fragmens ♦ dNTP-k TTG*TGG -------- 3’ AAC ACC 5’ 14
