196841. lajstromszámú szabadalom • Eljárás xilóz-izomeráz előállítására, immobilizálására és glükóznak fruktózzá történő izomerizálására
1 2 196 841 A 4. oszlop b, táptalaja azonos az 1. oszlop b táptalajával, üe a b’ 1%, a b 0,5% glükózt tartalmaz. Az a’ és a táptalaj között ugyanilyen viszony van. 5 A táptalajfüggő hozadék százalékos arányát úgy számoljuk ki, hogy kifejezzük a glükózt, illetve a xilózt tartalmazó táptalajon végzett fermentációk GINU/ml értékben kifejezett hozadékának százalékos arányát, például a DSM 3253 törzs esetében ir (11. oszlop): alJehidet adunk hozzá, és a keverék kémhatását nátrium-hidroxid hozzáadásával pH = 7,5 értéken tartjuk. Egy óra elmúltával 500 ml ionmentesített vizet adunk hozzá, és a keveréket ugyanazokkal a flokkulensekkel flokkuláljuk, mint az 5. példában. A szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk, granuláljuk és szárítjuk. A szárított granulátum aktivitása 184,5 g glükóz-izomeráz egység grammonként (az aktivitás egységét az F-850399 NOVO dokumentum határozza meg). ■ ~£6£2 x 100% = 99% A 3. oszlop adataiból kitűnik, hogy a DSM 3253 -jg törzs több xilóz-izomerázt termel a glükózt tartalmazó b táptalajon, mint a xilózt tartalmazó a táptalajon. A felsorolt többi törzs egyike sem rendelkezik ezzel a sajátságos tulajdonsággal. A táblázatból az is kitűnik, hogy az eddig „konstitutívnak” nevezett törzsek táptalajfüggő hozadékának százalékos aránya 20 sokkal alacsonyabb a találmányban szereplő konstutív DSM 3253 törzs százalékos arányához képest. A 9. oszlopba B’ táptalajnál feltüntetett adatok lehetővé teszik, hogy pontos számításokat végezhessünk, a táptalajfüggő hozadék százalékos arányára. 25 5. példa Az alábbiakban ismertetjük a DSM 3253 törzs által termelt xilóz-izomeráz immobilizálási eljárását. A tenyésztést a 2. példában leírtak szerint, xilózt tartalmazó táptalajon végezzük. A fermentlevet centrifugáljuk, és a felülúszót eldobjuk. Az üledékel, ami a xilóz-izomeráz aktivitással rendelkező sejteket tartalmazza, fagyasztva szárítjuk. 6 g fagyasztva szárított sejtet adunk 150 g ionmentes vízhez, ami 3 g porlasztva szárított tojás albumint tartalmaz. A kémhatást pH = 5,90-ről 35 7,55 értékre állítjuk be, és 2,75 ml 50%-os glutáraldehidet adunk az oldathoz, kialakítva ezzel a proteinek közötti keresztkötéseket. A kémhatást pH = 7,5 értéken tartjuk 35 percen át, majd 250 g ionmentesített vízzel hígítunk. A keveréket 30 ml Superfloc C 8351, kationos flokkulenssel és 4,5 40 ml AI 30 anionos flokkulenssel flukkoláljuk. A szilárd anyagot szűréssel eltávolítjuk, granuláljuk és szárítjuk. A szárított granulátum aktivitása 78,8 glükóz-izomeráz egység grammonként (az aktivitási egységet az F-850399 NOVO dokumentum határozza meg). 45 6. példa A DSM 3253 által termelt xilóz-izomeráz immobilizálásához szükséges fermentlevet glükózt tartalmazó táptalajból nyerjük a 2. példában leírtak sze- „ rint. A fermentlevet centrifugáljuk, a felülúszót eldobjuk. A sejtüledéket közvetlenül felhasználjuk az immobilizációs kísérletekhez. 6 g porlasztással szárított tojásalbumint adunk 100 g sejtüledékhez, melynek szárazanyagtartalma 8.9%. Az össztérfogatot ionmentesített vízzel 1200 55 ml térfogatra egészítjük ki, és a keverék kémhatását pH = 7,5 értékre állítjuk be. 4,6 ml 50%-os glutár-7. példa . A példában a DSM 3253 törzzsel előállított és immobilizált glükóz-izomeráz alkalmazását szemléltetjük. 11,7 g, a 6. példában előállított szárított granulált terméket 200 ml 45 súlyszázalékos glükóz szirupban áztatunk pH = 7,5 kémhatáson 2 órán keresztül. Az enzim granulátumot ezután vízköpenyes oszlopba visszük, és szobahőmérsékleten folyamatosan nyomjuk át rajta a 45 sűlyszázalékos glükóz szirupot, ami pH = 7,5 kémhatású, 2 mM nátrium-hidrogén-karbonátot és literenként 0,4 g magnézium-szulfát-7-vizet tartalmaz. Egy óra múlva az oszlop hőmérsékletét 60°C-ra emeljük, és az áramlás sebességét úgy állítjuk be, hogy a fruktózzá való átalakítás 41-44,5 százalékos legyen. Az izomerizálás első 137 órájában az aktivitás növekszik, 137 óra elmúltával 0,88 g szárazanyagtartalmú szirup áramlik át óránként az enzimkészítmény egy grammján, és a szirupban az átalakítás 44,3%-os. A kísérletet 328 óra után leállítjuk, ekkor 1.03 g szárazanyagtartalmú szirup áramlik át óránként 1 g enzimkészítményen és a szirupban az átalakítás 42,0%-os. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás xilóz-izomeráz előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces murinus csoportba tartozó törzset süllyesztett tenyészetben, aerob körülmények között tenyésztünk megfelelő szénás nitrogénforrást tartalmazó táptalajon, majd a keletkezett xilóz-izomerázt a fermentléből kinyerjük, és kívánt esetben megfelelő hordozón immobilizáljuk, 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces murinus csoportba tartozó törzsként a DSM 40091, DSM 40240, NRRL 8171, FERM P-3710 vagy a DSM 3252 törzset tenyésztjük. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 lern e z v e, hogy a Streptomyces murinus csoportba tartozó törzsként konstitutív törzset tenyésztünk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces murinus csoportba tartozó törzsként a DSM 3253 törzset tenyésztjük. 5. Eljárás glükóznak fruktózzá történő izomerizálására, azzal jellemezve, hogy a glükózt vizes oldatában izomerizáljuk a Streptomyces murinus csoportba tartozó törzzsel az 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított xilóz-izomeráz. a) oldható készítményével, vagy b) immobilizált enzimkészítményével. rajz nélkül Kiadja: Országos Találmányi Hivatal Felelős kiadó: Himer Zoltán o.v. 8 KÓDEX
