196841. lajstromszámú szabadalom • Eljárás xilóz-izomeráz előállítására, immobilizálására és glükóznak fruktózzá történő izomerizálására
1 2 1. példa A példában a rázott lombikos fermentációkat ismertetjük. A Streptomyces murinus csoportba tartozó mind a hat fent említett törzset tenyésztjük a xilóz-izomeráz termelése céljából. Valamennyi törzset egy napon át növesztjük 37°C hőmérsékleten az alábbi összetételű ferde agaron: pepton (Difco) 6g pepticase (llumco) 4 g élesztőkivonat 3 g glükóz 1 g húskivonat 1.5 g aga r desztillált vízzel 1 literre feltöltve 2,0 g pH = 7,3 500 milliliteres, horpasztott oldalú Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml termelő táptalajt oltunk be az egyes törzsek 5 ml térfogatú sejtszuszpenziójával. Az a és b termelő táptalaj (pH= 7,2) összetétele az alábbi: a kukoricalekvár 60 g ammónium-szulfát 5 g dikálium-hidrogén-foszfát 1,5 g pluronic (nem-ionos detergens) 0,3 g xilóz 5 g csapvízzel 1 literre kiegészítve b kukoricalekvár 60 g ammónium-szulfát 5 g dikálium-hidrogén-foszfát 1,5 g pluronic 0,3 g glükóz 5 gt~ csapvízzel 1 literre kiegészítve A xilózt és a glükózt külön autoklávozzuk, és lehűlés után sterilen adjuk a táptalajhoz. A beoltott lombikokat 30°C hőmérsékleten inkubáljuk. 72 órás inkubálás után megvizsgáljuk a fermentlé xilóz-izomeráz aktivitását. A kapott eredményeket a III. táblázatban foglal juk össze. III. táblázat Xilóz-izomeráz termelés törzs izomeráz aktivitás GINU/ml (2-4 fermentáció átlaga) a táptalaj b táptalaj ___(Q.5% xilóz) (0.5% glükóz) DSM 3252 2,4 0,4 DMS 3253 4,6 5,3 DSM 40091 1,9 0,3 DSM 40240 2,8 0,3 NRRL8171 2,6 2,4 FF.RM P-3710 2,8 0,3 Fgy GINU egyenlő azzal az enzimmennnyiséggel, ami percenként 1 /tmól glükózt izomerizál fruktózzá. Az izomerlzálás előtt 2 mg/ml lizozimmel kezeljük a mintát 37°C hőmérsékleten, 30 percen át, és annyi megfelelő sót adunk hozzá, hogy a Mg és Co** ion koncentrációja 0,1 M, illetve 0,002 M legyen. Az izomerizálást 65°C hőmérsékleten végezzük 0,25 M malcát pufferben, melynek kémhatása pH = 6,50 és 5% glükózt, 0,05 M Mg \ 0,002 M Co iont és 0,05% kloroformot tartalmaz. 20 perc elteltével a reakciót 0,1 M perklórsav hozzáadásával leállítjuk. 6 A keletkezett fruktózt cisztein-karbazol reakcióval határozzuk meg (Lloyd és munkatársai, Cereal Chemistry, 49, 544/1971/). 2. példa A példában az 1,5 liter táptalajban történő fermentálást ismertetjük. A DSM 3252 és a DSM 3252 törzseket úgy növesztjük ferde agaron, ahogy azt az I. példában leírjuk, de 30 C hőmérsékleten. Fgy napos inkubálás után a telepeket összegyűjtjük, és felhasználjuk 1.5 liter táptalaj oltására. A fermentorok táptalajának összetétele literenként: 40 g kukoricalekvár, 4.5 g ammónium-szulfát, 1,5 g dikáhum-hidrogén-foszfát, 4,5 g ammónium-szulfát, 1,5 g dikálium-hidrogén-foszfát, 0,33 ml Pluronic habzásgátló és/ vagy 5 g glükóz, vagy 5 g xilóz. A glükózt vagy xilózt külön sterilezzük. Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását pH = 0,7 értékre állítjuk nátrium-hidroxid oldattal. A fermentálást 30°C hőmérsékleten végezzük, percenkénti 750 fordulatszámú keveréssel és percenként 0,6 térfogatnyi levegőárammal. Három nap elmúltával a IV. táblázatban bemutatott eredményeket kapjuk. IV. táblázat ___________________DMS 3252 DSM 3253 szénhidrát glükóz xilóz glükóz xilóz GINU/ml_________0,53 3,20 4.78 4.87 1500 liter táptalajban az alábbiak szerint végezzük a fermentálást. A DSM 3253 törzset az 1. példában leírtak szerint növesztjük ferde agaron, de 30°C hőmérsékleten. Kétnapos inkubálás után az összegyűjtött telepekkel beoltunk 300 1 táptalajt, ami 12 kg kukoricalekvárt, 1,5 kg külön sterilezett glükózt és 50 ml Pluronic habzásgátlót tartalmaz. Sterilizálás előtt a táptalaj kémhatását nátrium-hidroxiddal pH = 7,0 értékre állítjuk be. A fermentálást 30°C hőmérsékleten végezzük percenként 200 fordulatszámú keveréssel és percenként 200 liter levegő átáramoltatásával. 25 óra után 150 liter tenyészettel oltjuk be ebből a fermentorból az 1500 liter táptalajt, ami 60 kg kukoricalekvárt, 6,75 kg ammónium-szulfátot, 2,25 kg kálium-dihídrogén-foszfátot és 250 ml Pluronic habzásgátlót tartalmaz. A sterilizálást 121°C hőmérsékleten végezzük 60 percig. A táptalaj kémhatását sterilizálás előtt pH = 7,0 értékre állítjuk be. A fermentáció hőmérséklete: 30ÖC, kevertetés: percenkénti 190 fordulatszámmal, levegőáram: percenként 1000 liter. 3 óra elteltével 8 kg glükózt adagolunk és a 10. órától kezdve folyamatosan adagoljuk a glükózt óránként 0,5 kg-os sebességgel. 87 óra elmúltával a fermentlé aktivitása: 11,9 GINU/ml. 4. példa összehasonlítjuk a rázott lombikos fermentációkat, melyek egy részét a jelen találmány szerinti, másokat az ezt megelőző eljárások szerint végezzük. A fermentációkhoz az V. táblázatban megadott táptalajokat használjuk fel. Kétnapos fermentációkat végzünk 30°C hőmérsékleten. A fermentációk glükózt, illetve xilózt tartalmazó táptalajon nyert hozadékának arányát a „táptalajfüggő hozadék 96 84 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
