196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
£ lesz lő sejt mentes felülúszó 0,3/0,1% 0,8/0,3% 164/62.1% Élesztő fel tiírt sejt szuszpenzió 0,7/0,3% 0,7/0,3% 151/57,2% Az eredmények a Vlll-as faktor aktivitás baktérium és élesztő tenyészlevekből és feltárt sejtszuszpenziókból való nagy tisztaságú és jelentős mértékű kinyerését bizonyítják. 2. példa Ez a példa humán szérum-albumin elválasztását mutatja be baktérium és élesztő-tenyészetekből polielektrolit kopolimeres adszorpcióval. Az E. coli és S. cerevisiae sejteket a fenti, első példa szerint tenyésztjük és dolgozzuk fel. A humán szérum albumint (Conn Factor V., J. A. C. S., 68, 459 /1946/) a sejtmentes felülúszókban és a feltárt sejtek fiziológiás só-oldatban (30—190 ml hígítás) készült folyadék fázisának hígításában inkubáljuk. Az albumint ezután a megfelelő frakciókból a következő, vízben oldhatatlan, térhálós polielektrolit polimer gyantán (B gyanta) adszorbeáltatva választjuk el: A B gyanta 90 mól % függő dimetil-amino-propilimid csoportot tartalmazó, 5 mól % metilimino-bis(propilamin)-nal térhálósított, lényegében ekvimoláris mennyiségű etilénből és maleinsav-anhidridből készült kopolimer. Ezt a polielektrolit kopolimert a reagensek és mólarányok szempontjából lényegében a 4 097 473 és 4 118 554 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 1. példájában és a 4 157 431 sz. Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás 12. példájában leírt módszerekkel állítjuk elő. A jelen példa szerint 200 mg/ml koncentrációjú albumin oldatból 2,4 ml-t keverünk, az előzőekben említett sejtmentes felülúszók és feltárt sejt hígítások 20 ml-es mintáiba. Ezeknek a mintákban vizsgáltuk a teljes fehéije-tartalmát az albumin hozzáadása előtt és után, hogy egy alapvonalat és a kezdeti albumin-szintet meghatározzuk. A teljes fehérjetartalmat a Bio-Rad Assay Kit-tel határoztuk meg, mely a kereskedelmi forgalomban kapható (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.) Ez a készlet Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 /1976/) módszerén alapuló festék-kötési mérőmódszert nyújt és a különböző fehérje-koncentrációkra adott differenciális festék színváltozást méri. Mindegyik albumin-tartalmú keverékből 20 ml-t elkeverünk 200 mg B gyantával. A gyanta-szuszpenzió píl-jál 7,0-ra állítjuk, 30 percig keverjük, szűrjük, majd a gyantát háromszor mossuk 50-50 ml ionmentes vízzel. Az egyesített mosófolyadékoknak az előzőeknek megfelelően meghatározzuk az összes fehérje-tartalmát. A gyanta-lepényeket 20-20 ml 0,04 mólos nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, pH-ját 4,0-ra állítjuk és a leoldott albumint tartalmazó vizes fázist szűréssel választjuk el. A leoldott minták összes fehéije-tartalmát az előzőek szerint határozzuk meg. A kinyert albumin mennyiségét az ,Albumin Standards and the Meascerement of Serum Albumin with Bromcresol Green” (Clin. Chcm. Acta 31, 87 /1971/) cikkben leírt speciális módszerrel is meghatározzuk. Az összes fehérjetartalomra és az albumin mennyiségére vonatkozó vizsgálati eredményeket a következő II. Táblázatban foglaljuk össze: II. Táblázat Vizsgált minta Mikrobiális keverék E. coli Élesztő •f Sejtmentes felülúszó Feltárt sejtszuszpenzió Sejtmentes felülúszó Feltárt sejtszuszpenzió TPC (mg) Kezdő alapvonal 0,43 67 0,65 71 TPC (mg) Albumin tartalmú minták 624 647 576 600 TPC (mg) ' Mosófolyadék minták 15 0,42 0 7 TPC (mg) leoldott minták 431 456 337 433 Kinyerés (%-os alap) összes fehérje) 69,0 70,5 58,5 72,0 Kinyerés (%-os alap) Albumin 60,5 95,6 63,9 65,0 + összes fehérje tartalom A fenti mintákat SDS-poliakrilamid gél-elektroforézissel Is megvizsgáljuk. Az SDS elektroforézls során a mintákat röviden nátrium-dodecil-szulfáttal felmelegítjük, majd 7%-os poliakrilamid gél-elektroforézisnek vetjük alá konstans 20 -40 mA/gél áramerősséggel, és a gél molekuláris szűrő hatása alapján a méret szerint elválasztjuk. A vándorlás sebessége kapcsolatban áll a molekulasúllyal. A géleket Coomassie Blue R-250 festékkel festjük meg és sűrűség-pásztázó technikákkal értékeljük. Az elektroforézis megerősíti az albumin kiváló elválasztását a mikrobiális és élesztő fermentlevek egyéb komponenseivel alkotott komplex keverékekből. 3. példa Ez a példa bemutatja a humán Vlll-as plazmafaktor elválasztását emberi májsejt-tenyészetből polielektrolit kopolimerekkel végzett adszorpcióval. SK-HEP-1- májsejteket növesztünk 37°C-on, Dulbecco módosított minimál esszenciális táptalajban (MÉM), mely 4,5 mg/ml glükózt tartalmaz (KC Biologicals). A tenyésztő közeget 5 térfogat %borjú szérummal egészétjük ki. A sejteket 75 cm2-es T-lombikokban (Falcon Plastics) először tapadó tenyészetben addig tenyésztjük, míg egybefüggő réteget nem képeznek, majd a sejtek egy részét forgatott lombikokban levő, kevert folyadék-szuszpenziós tenyészetbe visszük és ott fenntartjuk, lényegében a 4 059 485 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban közölt eljárás szerint. A sejteket és a sejtmentes felülúszókat kinyerjük a T-lombikokban és a forgatott lombikokban levő sejttenyészet rendszerekből. A sejteket centrifugálással választjuk el a felülúszóktól, és négyszer fagyasztva-olvasztva tárjuk fel. A humán Vlll-as plazma-faktor kereskedelmi for-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
