196832. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-proteinek elválasztására sejttenyészetekből
1 2 A találmány tárgya eljárás vérplazma fehérjék elválasztására sejt tenyészet rendszerekből, úgymint például mikrobiáíis sejttenyészetek fermentációs közegéből és emlős sejttenyészetek felhasznált tápközegéből. Az emberi plazmában vagy szérumban előforduló különböző fajta fehérjék frakciónál! elválasztása sok éve foglalkoztatja az orvosi és gyógyszerészeti területen dolgozó tudósokat. Ennek az érdeklődésnek jelentős részét képezik a véralvadásért felelős plazmakomponensek, azaz a vér koagulációs faktorok izolálására végzett kutatások. Más, nagy orvosi érdeklődésre számot tartó vérfehérje komponensek az antitest aktivitást hordozó gamma globulinok és a plazma főkolloid-ozmotikus regulátora, az albumin. A legfontosabb plazmafehérje, fajtákat, manapság ipari méretekben emberek által adott vérből, mint természetes anyagforrásból gyűjtik. A vérplazma-fehérje fajták izolálásának fontosságát könnyen bemutathatjuk az antihemofíliás faktor (AUF, VIII-as faktor) kereskedelmi forgalma iránti igényén. A VlU-as faktor kritikus szerepe a homeosztárisban és véralvadásban jól ismert. A legtöbb veleszületett véralvadási rendellenességben szenvedő beteg VH-as faktor hiányában szenved (hemofilia A betegek) míg kisebb számban találhatók a IX-es faktor hiányában (hemofilia B betegek) vagy egyéb minor alvadási faktor hiányában szenvedő beteg. Az ilyen alvadási rendellenességben szenvedő betegek a múltban teljes vérplazma transzfűzióra vagy előnyösen plazma sűrítményekre szorultak, melyeket a magasabb VIII-as vagy IX-es faktor koncentráció elérése céljából tisztítottak. Kriokicsapásos, például a Judith Pool által kifejlesztett (New England, J. Med., 274, 1443 -47 /1963/) vagy még koncentráltabb frakciók, például Hemofil^ AHF, melyet a 3 415 804, 3 631 018,4 089 944 és Re 29 698 számú Amerikai Egyesült Államok-be!i szabadalmi leírásban közölt módszerekkel állítanak elő, tipikus példái a magas VIII-as faktor koncentrációval rendelkező, kereskedelmi forgalomban levő frakcióknak. Ezek a kereskedelmi célokra előállított frakciók azonban egy szűkös nyersanyagbázis, a véradók által adott vér mennyiségétől függnek. A hagyományos ipari mikrobiológiai eljárásaira alkalmazott génsebészet és molekuláris biológiai legújabban kifejlesztett technikáival ma már elérhető, hogy emlős pl^zmafehérjéket állítsunk elő mikroorganizmosokkal. így a gén-illesztés fő tervezői közölték módszerük használhatóságát a különböző plazmafehérjék, például antihemofilia fehérje, gamma globulinok, albumin, fibrinogén és protrombin előállítására. (Lásd Cohen and Boyer, 4 237 224 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás 9. oszlop). Míg a génsebészet aktuális korai munkája viszonylag kis fehérjék, úgymint szomatosztatin és inzulin előállítására korlátozódott, az idegen fehérjék baktériumokban és élesztőkben való előállításának génsebészeti alapelvciről bebizonyosodott, hogy alkalmazhatók sokkal nagyobb fehérjékre. A rekombináns mikroorganizmusokkal termelt viszonylag nagy fehérjékre példa a körülbelül 43000-es molekulasúlyú ovalbumin, a 2 923 297 és 2 933 000 számú Német Szövetségi Köztársaság-beli közzétételi irat szerint, és a 2 458 585 és 2 476 1 26 számú francia szabadalmi bejelentés szerint, valamint az 585 aminosavból álló láncú humán szérum albumin (l^awn és munkatársai, Nucleic Acids, Res., 9 (22), 6103 - 6114 /1981/). A Nature, 312, 330-337. (1984) cikkében William I. Wood és munkatársai humán VIII-as faktor kifejezését ismertetik rekombináns DNS kiónokkal. E cikkben is kifejtik a szerzők, hogy a kapott elegyek feldolgozása komoly problémát jelent, többek között az ilyen elegyekben ■keletkező protein csapadékok és veszélyes potenciális kórokozók (hepatitis, AIDS) következtében. Felismertük, hogy igény van használható módszer fejlesztésére plazmafehérjék elválasztására sejttenyészet rendszerekből. Bármely kiválasztott speciális fehérje elválasztása a fermentációs tápközegekben és felhasznált közegben jelenlevő más fehérjékből és sejtalkotókból, rnetabolitokból, sejttörmelékekből és hasonló anyagból álló keverékből, nagy nehézségekkel jár. A múltban a fehérjetermék kinyerése a fermentációs közegekből és felhasznált közegekből számos különböző eljárással történt. Extrakció a sejtekből vagy sejtalkotókból történő felszabadítással, a sejt fal vagy membrán mechanikai, Fizikai vagy kémiai roncsolásával pl. homogenizátorok használatával vagy vizes és szerves oldószeres extrakció alkalmazásával. — Kicsapás kisózással sókkal, mint pl. ammónium-szulfáttal vagy szerves oldószerek pl. etanol, metanol vagy izopropanol használatával, vagy nagymolekulasúlyú polimerekkel, pl. polietilén-glikollal és dextránnal vagy fém-ionokkal és komplexekkel, vagy különböző hőmérsékleti és pH-körülmények használatával. — Adszorpció kolloid anyagokkal, úgymint bentonit, kalcium-foszfát, bárium-szulfát, hidroxiapatin, aktív szén, szilika- vagy alumínium-hidroxid gélek, Centrifugálás, szűrés, szűrési segédanyagok nélkül vagy segédanyagokkal, úgymint kieselgél és más ilyen diatómaföldek, vagy ultraszűrés, Kromatográfiás gélszűréssel és ion-cserélő gyantákkal, úgymint SpphadexK (térhálósított dextrán) gélek, SepharoseK (agaróz) gélek és DEAE-Sephadex vagy DEAE-cellulóz-ion cserélő gyanták. Elektroforézis Ultracentrifugálás, és Befejező műveletek úgymint sótlanítás, sűrítés és szárítás, Egy újabban kifejlesztett fehérje-kinyerési és izolálási módszer lényege immun-affinitás kromatográfia. Egy adott proteinhez affinitással rendelkező monoklonális antitesteket poliszacharid gyöngyökhöz köthetünk, majd ezeket kromatográfiás oszlopba helyezzük. Ha a nyers fehérje-oldatot átbocsátjuk az oszlopon, a kiválasztott fehérje-molekulák adszorbeálódnak a gyöngyökön, míg a szennyezések és a nem kívánt anyagok keresztülfolynak az oszlopon. A kívánt fehérjét ezután leoldjuk a gyöngyökről egy megfelelő mosó-oldat pH-jának beállításával. A találmány tárgya eljárás plazmafehérjék elválasztása sejttenyészet rendszerekből készített keverékekből vízben oldhatatlan, térhálósított polielektrolit kopolimereken való adszorpcióval. Ezek a polielektrolit kopolimerek 2-4 szénatomszámú, olefin típusú telítetlen monomerek és di-(kis szénatomszámú alkilamino-kis szénatomszámú alkilmid) funkciós csoportokat tartalmazó 4-6 szénatomszámú, telítetlen polikarbonsavak vagy anhidridek kopolimerjei. Amint az alábbiakban használjuk, kis szénatomszámú alkil jelentése 1-4 szénatomszámű alkjlcsoport. A megfelelő olefin-típusú telítetlen monomerekre jellemző példa az etilén, propilén és izobutilén, a megfelelő a , 0 telítetlen polikarbonsavakra vagy anhid-96 832 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
