196815. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új foszfino-szénhidrogén-származékok arany, ezüst- és rézkomponenseinek előállítására, valamint foszfino-szénhidrogén-származékok arany-, ezüst- és rázkomplexeit tartalmazó daganatos sejtek szaporodását gátló gyógyászati készítmények előállítására
5 196 815 6 megfelelő, X helyettesítőként nilrátionl tartalmazó (1) általános képletű vegyülclet például nátrium - [hexa‘fluoro - foszfát] vizes oldatával reagáltatjuk. Azokat az (I) általános képletű vegyületeket, amelyekben X kloridion, R és Rl azonosak, jelentésük rendcsoport és A jelentése cisz - CM—CM- vagy — (CH2),-képletű csoport vagy R és R1 azonosak, jelentésük etilcsoport vagy R1 etilcsoport jelentése mellett R jelentése fenilcsoport és A jelentése az előzőekben megadott, az előzőekhez hasonlóan, a megfelelő (IV) általános képletű vegyületnek 0,5 mólekvivalens réz(I)-kloriddal való reagáltatásával állítjuk elő. Azoknak az (I) általános képletű vegyületeknek az előállítására, amelyekben X jelentése nitrátion, Carty és munkatársai eljárását )Can. J. Chcm., 49, 761-766 (1971)] alkalmazhatjuk, azaz feleslegben lévő (ÍV) általános képletű vegyüíetet réz(II) - nitráttal reagáltatunk. Azokat az (I) általános képletű rézkomplexeket, amelyekben X jelentése [hexafluoro - foszfát] - ion, a megfelelő, X helyettesítőként kloridiont, tartalmazó vegyületnek például nátrium - [hexafluoro - foszfát] vizes oldatával való reagáltatásával állítjuk elő. Amint azt az előzőekben már ismertettük, az (I) általános képletű vegyületek tumorsejt-szaporodást gátló hatásúak. A vegyületek aktivitását különféle vizsgálómódszcrck alkalmazásával igazoltuk. A B16 mclanomasejt vizsgálatban in vitro merjük a vizsgálandó vegyületek két órás hatása után a sejtek szaporodási képességét. Az (I) általános képletű vegyületek citotoxikus hatását először in vitro vizsgáltuk BI6 melanomasejíeken a következő módon: B16 melanomasejteket alkalmazunk (erősen áttételképző vonal, F 10) egyrétegű tenyészet formájában 10% marhaszérummal és 1% antibiotikummal kiegészített minimál esszenciális tápközegen (Minimal Essential Media, Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) A tenyészetet 5% szén-dioxidot tartalmazó, nedvesített légterű inkubátorban 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az aszinkron scjttenyészelet őszszegy üjtjük és 60 mm x 15 mm-es steril petri lemezekre visszük lemezenként 5000 sejt mennyiségben. A tenyészeteket éjszakán át inkubáljuk, hogy a sejtek a lemezekhez tapadjanak. Ezután a sejteket steril körülmények között valamely (1) általános képletű vcgyülettcl vagy cisplatinnal kezeljük, az alkalmazott anyagokat 2 óráig hagyjuk hatni, majd kiszívjuk a tápközeget. A lemezeket 5 ml foszfáttal pufierolt sóoldattal (PBS) átmossuk, ezután 5 ml friss tápközeget adunk a lemezre, majd a tenyészetet 37 °C-on, C02-l tartalmazó légterű inkubátorban 5 napig inkubáljuk. A sejtek életképességét azzal a képességükkel mérjük, hogy képeznek-e 50-nél több sejtből álló telepet. A telepeket 95%-os etanolban készített 0,5%-os kristályibolya oldattal fixáljuk. E lemezeket szárítjuk, majd a telepeket Biotran III automatikus számlálóberendezéssel (New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J.) megszámoljuk. Minden egyes koncentrációra három párhuzamos vizsgálatból számítjuk az átlagértéket és a standard deviációt. Az adatokat a túlélő frakció logaritmusát (a telepek száma a vizsgálandó vegyülettel kezelt lemezeken/a telepek száma a kontroll lemezeken) a vizsgált vegyü- Iet koncentrációja függvényében ábrázolva elemezzük. Néhány (1) általános képletű vegyület ÜI6 nclnnomasejteken in vitro végzett vizsgálatának er:.’.ményét az I. táblázatban ismertetjük. Egy másik in vitro vizsgálatban az 1. táblázat 1. számú vegyületek 10 gmól/l alatti koncer t.'adóban alkalmazva 2 órás hatásidő alatt hatókon; an pusztította a HT-29 humán vaslagbélkarcinóm: sejteket. A tumorgátló szerek szkrinclésérc és r; aktiv vegyületek alaposabb vizsgálatára napjain!tan legáltalánosabban alkalmazott állati tumor rrcdell a P388 limfocita leukémia modell. Ez a tumorreodszer széleskörűen elfogadott a tumorgátló anyagok vizsgálatára, mivel lényegében minden klinikailag aktív daganatgátló szerre érzékeny, mennyiségi és reprodukálható eredményt ad, kiterjedt szkrinclésre is használható és előre jelzi a más állati tumor-modelleken várható aktivitást. Azok a szerek, amelyek az intraperitonealis (ip.) P388 tumormodeliben aktívak, általában más tumormodeüekben is aktívak. Az(l) általános képletű vegyületek tumorgátió hatását P388 leukémia-sejteken vizsgáltuk a következő módon. 106 P388 leukémiasejtet ip. B6D2F, egérben tenyésztünk. 24 óra múlva - amennyiben a tumortenyészet tiogükolát levesen 24 órán át tenyésztve baktériummentesnek bizonyul - az állatokat véletlenszerűen 6 fős csoportokra osztjuk és cipősdobozokban helyezzük el. A fcmkomplexckcl oldhatóságuktól függően - minimális mennyiségű N,N - dimetii - acctamidban (DMA) vagy 95%-os etanolban oldjuk fel. Az oldalhoz azonos térfogatú sóoldatot adunk, ha a komplex kiválik az oldatból, azonos térfogatú Cremophort (polietoxilált ricinusolaj) adunk hozzá, majd annyi sóoldatot, hogy a kívánt dózist 0,5 ml végiéi fogatban kapjuk. A DMA, az etanol és a Cremophor koncentrációja a kész oldatban 10%. A kisebb dózisokat ebből az oldatból sóoldatos higitással készítjük, így a dózis csökkenésével csökken a hordozóanyag szerves oldószer tartalma. Az alkalmazott hordozóanyagokkal oldat vagy szuszpenzió formájú készítményeket állítunk eiő. A készítményeket közvetlenül a beinjektálás előtt készítjük cl. Az (1) általános kcplctű hatóanyagot ip. adjuk be az 1—5. napon, azaz a kezelést a tumorsejtek bevitelét követően 24 órával kezdjük meg. Minden vizsgálatban 3, egyenként 6 állatból álló kontrollcsoportot alkalmazunk, egy kezeletlen kontrollcsoportot és két pozitív kontrollcsoportot, amelyeknek cisplalint adunk kél különböző dózisban. Az állatokat az 1., 5. cs 9. napon csoportonként megmérjük, az észlelt átlagos tömegváltozást a toxieitás következményének tekintjük. Minden vizsgálatban szerepet még egy 8 egérből álló, 10M00 P388 leukémiasejttel ip. fertőzött „fertőzés titrálási” (inoculum titration) csoport is. A titráiás alkalmas arra, hogy a vizsgált vegyülettel elpusztított sejtek számát kiszámítsuk. Az állatok pusztulását naponkénti megfigyeléssel követjük nyomon, a vizsgálatot 45 nap elteltével fejezzük be. Meghatározzuk az átlagos túlélési időt és az élettartam növekedést amely az átlagos túlélési idő százalékos növekedését jelenti a kezeletlen kontrolihoz képest. A I0Ö P388 leukémiasejttel befertőzött kezeletlen kontroll átlagos túlélési ideje általában 10-11 nap. A vizsgált vegyüíetet akkor tekintjük hatásosnak, ha az általa előidézett élettartam növekedés >25%. Az (I) általános képletű vegyületek in vivo P 388 leukémia modellen kifejtett hatását bemutató eredményeinket a 2. táblázatban ismertetjük. 5 IC U 2Ü 25 30 35 40 45 EO f>5 f>0 35 4
