196627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 9 alfa-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion mikrobiológiai előállítására
1 196 627 2 A találmány tárgya új eljárás 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-dion előállítására természetes eredetű szterinck oldalláncának mikrobiológiai lebontása útján. A 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-dion a kortikoszteroid-gyógyszerek szintézisének fontos kiindulási anyaga (V. Van Rheenen, K. P. Shephard: J. Org. Chem. 44, 1582 /1979/). A szabadalmi irodalomban régóta ismeretes a 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-dion előállítása az androsztánvázas szteroidok mikrobiológiai úton végzett hidroxilezésével. A Nocardia genus-ba tartozó Nocardia corallina-val (862 701 számú angol szabadalmi leírás) és Nocardia canicruria-val (4 397 947 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), valamint a Corynebacterium genus-ba tartozó Corynchaclcrium ct|tú-vel (79-147908 számon közrebocsátott japán szabadalmi bejelentés) 4-androszlén-3.17- diont hidroxilezve nyertek 9a-hidroxi4-androsztén-3,17-diont. A Caliciales gombarendbe tartozó Corynespora cassiicola-va! is hidroxilcz.lék 9a-hclyz.ctbcn a 4-androsztén-3,17-diont (80-77897 számon közrebocsátott japán szabadalmi bejelentés), a Mucorates rendbe tartozó Circinella niuscae-val pedig tesztoszteronból (P. G. Rao; Indian J. Chem. 1, 314 /1963/) készítettek 9a-hidroxi4-androsztén-3,l 7-diont. Újabban állati és növényi szterinek mikrobiológiai lebontásával állítanak elő 9a-hidroxi4-androsztén-3.17- diont. A szabadalmi irodalom szerint az átalakítást az alábbi mikroorganizmusokkal végzik: Mycobacterium fortuitum-mal (4 175 006 számú és a 4 035 236 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások), Mycobacterium parafortuitummal (80-138395 számon közrebocsátott japán szabadalmi bejelentés), Mycobacterium vaccae-val (80-085397 számon és a 82-0879 számon közrebocsátott japán szabadalmi bejelentések). A szterinek, és ezek közül is különösen a növényi eredetűek (/3-szitoszterin, kampeszterin) olcsó, könynyen hozzáférhető kiindulási anyagok. Ezért a 9aliidroxi4-androsztén-3,!7-dion szterinek lebontásával történő előállítása gazdasági szempontból nagyon előnyös lehetőséget jelent. Ipari megvalósítás esetén azonban a fenti szterinlebontási eljárások hátránya az, hogy a fermentációs idő hosszú, és a 9a-hidróxi4-androsztén-3,l 7-diont viszonylag alacsony termelési szinttel állítják elő. Kutatásaink során, G. E. Peterson és munkatársai által kidolgozott módszerrel (J. Lipid Research 3, 275 /1962/), különböző talajmintákból szitoszterint bontó mikroorganizmusokat izoláltunk. E szterint hasznosító mikroorganizmusok közül kiválasztottunk egy Mycobacterium törzset, melyből az általunk korábban kidolgozott szferoplaszt és/vagy proloplaszt-inutációs módszerrel mutánsokat állítottunk elő. E munkánk során úgy jártunk el, hogy a kiválasztott törzset vankomicin tartalmú táptalajon előtenyésztettük, majd ezt követően lizozim enzimes kezeléssel eltávolítóitok a mikroorganizmus sejtfalát, majd a kapott szfcroplaszfokal és/vagy protoplasztokat szacharózzal ozmotikusán stabilizált közegben N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidinnel kezeltük. A mutagén kezelést követően a sejtfal regenerálására a szferoplasztokat és/vagy protopíasztokat ozmotikusán stabilizált szilárd agar táptalajon inkubáltuk a baktérium tenyésztéséhez optimális hőmérsékleten. A regenerált baktérium telepekből olyan mutáns törzseket választottunk ki, melyek szterinek oldalláncának lebontásával jelentős mértékben halmoztak fel androsztán vázas szteroidokat. E törzsek kiválasztásánál úgy jártunkéi, hogy a regenerált telepekről természetes szterineket (szitoszterin, koleszterin), valamint 9a-hidroxi4-androsztén-3,l 7-diont tartalmazó minimál agar táptalajokra és glicerin szénforrást tartalmazó agar táptalajokra oltottunk le. Azokat a törzseket, melyek glicerin és természetes szterin szénforrásokon jól nőttek, de 9a-hidroxi4-androsztén-3.17-dionon nem nőttek, kiválasztottuk. 14 000 fenti módon nyert izolátumot vizsgáltunk meg szterinlebontó képesség szempontjából, és olyan törzseket kerestünk, melyek 1,2-szteroid-dehidrogenáz enzim aktivitással nem rendelkeznek, és természetes szterinekbő! jelentős mennyiségű 9a-hidroxi4- androsztén-3,17-diont halmoznak fel. Közülük kiválasztottuk a legnagyobb mennyiségben 9a-hidroxi4- androsztén-3,17-diont termelő törzset. A taxonómiai vizsgálatok során e törzset egyetlen ismert Mycobacterium fajjal sem sikerült azonosítani. így megállapíthattuk, hogy e genuszon belül új fajnak tekinthető. Rendszertani bélyegeit a szterinek lebontására képes Mycobacterium fajok legfontosabb diagnosztikai karakterisztikáival az 1. sz. táblázatban hasonlítjuk össze. A Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 jelű típus törzse a Mycobacterium genus egy új, faji szinten elkülöníthető taxonja. Ez a már 45 C-on sem szaporodó szervezet élesen elhatárolható a Mycobacterium pitiéi-tői, ettől a még 52 °C-on is aktív, citrátot és szukcináíot hasznosító, arabinózbói, galaktózból és mannitbó! savat képező, mély sárga, illetve narancssárga telepeket fejlesztő fajtól; továbbá a Mycobacterium smegmatis-tól is, mely a Mycobacterium pilléihez hasonlóan jól növekszik szukcináton, citráton, sőt oxaláton és benzoáton is, amire a Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 nem képes. Ezenkívül, az utóbbival szemben, a Mycobacterium smegmatis csaknem minden diagnosztikai szénforrásból, így arabinózbói, galaktózból, szorbitból, mannitból, inozitbó! és fruktózbó! egyaránt savat termel. A Mycobacterium smegmatis nem éli túl a 60 °C-os négy órás hőkezelést és semmiféle pigmentet nem termel. A Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1 eltér a Mycobacterium fortuitum-tól is, melynek telepei mindig színtelenek, s alacsony hőmérsékleten nem növekednek. A Mycobacterium roseum sp. nov. 1108/1, ez a jellegzetesen vörösen pigmentált, gyorsan növekedő Mycobacterium, pszichrofil (hideg kedvelő, illetve hidegtűrő) és fejlett, vörös kolóniák alakjában még 6 °C-on is szaporodni képe«, Ugyanakkor a Mycobacterium fortuitum tipikus törzsei már 17 °C-on is gátlást szenvednek. A telepek és tenyészetek 100 %-os élénkvörös endopigmentáltságának különben azért is tulajdonítottunk nagy taxonómiai értéket, mivel Good (1985) a Mycobacterium fortuitum igen nagyszámú, több mint félezer törzsét átvizsgálva közöttük egyetlen pigmentáltat sem talált, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
