196625. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-b vírus vakcina előállítására
19 196 625 20 HindlII-fragmentumból áll. Egy másik transzformánsról kimutattuk, hogy egy olyan pRIT10765 plazmidot tartalmaz., amely az YEpl3 Hindlll-ba inszertált pRIT10759-ből származó Hindii! fragmentumból áll. A 7. ábra a pRITI0761 és pR!T10764 előállításának folyamatát ábrázolja. 12. példa Élesztőgomba transzformálása pRlT10764 és pRI'F10765 plnzmiddal pRIT10764 és pRlT10765 plazmidot izolálunk a 11. példában készült transzformánsok tenyészeteiből cézium-klorid + etidium-bromid sűrűség-gradiens-centrifugálással, és mindegyikből 10 jt/g mennyiséget alkalmazunk lcI697d élesztőgomba-törzs sejtjeinek transzformálására a 7. példában leírt eljárás szerint. A leucintól független transzformánsokat regenerációs agar-agaron elkülönítjük. E transzformációkból származó egyik leucintól független kolóniát 1 cl697d (pRIT10764) törzs elnevezéssel jelölünk. Egy másik transzformánst S. ccrcvisiac !cl697d (pRIT 10765) törzs elnevezéssel jelölünk. E törzsek tenyészeteit 2 % glukózzal és 20 üg/ntl arginjnncl kiegészített élesztő-nitrogén alapközegen 30 °C hőmérsékleten 620 pm hullámhosszon megfigyelt 0,80-0,88 optikai sűrűségig növesztünk, majd a sejteket összegyűjtjük, sejtmentes kivonatokat állítunk elő, és a 7. példában leírt módon a HBsAg-t Ausria® radioimmun-méréssel meghatározzuk. Az lcl697d (pRIT10764) kivonatai e mérés során pozitív eredményeket adnak meg akkor is, ha foszfáttal pufferolt konyhasóoldattal 1/1024-ig terjedő hígításokat alkalmazunk; ezzel szemben az lel697d (pRIT10765) törzs nem-hígított kivonatai egyértelműen negatív eredményeket adnak c mérés során, (icnclikni és nidioimnnm-mcghatározási bizonyítékok alapján azt következtetjük, hogy az S cerevisiae lcl697d (pRIT10764) törzs sejtjei HBsAg-t szintetizálnak, amely felhasználható vakcinában az emberi HBV-fertőzések elleni védelem serkentésére komoly mellékhatások nélkül. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás a HBsAg kódolására és élesztőgombában érvényesülésre képes nukleotid-szekvenciát tartalmazó, rekonibináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy IIBsAg kódolására képes nukleotidszekvenciát (HBV DNS) az élesztőgomba arg 3 génjéből származó regulátor szakasszal fúzióba viszünk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a regulátor szakaszként ^>YEura3arg3 restrikciós endonukleázza! való emésztésével kapott regulátor szakaszt viszünk fúzióba. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a regulátor szakaszként pYEura3arg3 HindlII restrikciós endonukleázzal végzett emésztésével előállított, az arg 3 gént specifikáló, 3300 bp értékű élesztőgomba-DNS-fragmentumot visszük fúzióba. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a HBsAg-szekvenciát és a regulátor szakaszt valamilyen vektorba inszertálva visszük fúzióba. 5. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, bogy a 1 IBsAg-szckvcnciaként a HBV DNSBamlll restrikciós endonukleázzal történő emésztésével előállított szekvenciát visszük fúzióba. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adw szerotípusú Dane-részecskékből kivont HBV DNS-ből származó Banilll-fragmcntumot egy előzőleg valamilyen vektorba inszertált regulátor szakasz valamilyen llindlll-fragmcntumának BgHI- helyére inszertáljuk. 7. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ayw szerotípusú Dane-részccskékböl kivont HBV DNS-ből származó BnmIII-fragmentumok fuzionált párjából kapott fragmentumot annak a vektornak Xbal helyére inszertáljuk, amely a pMC200- nak regulátor szakaszt tartalmazó és egyik végén EcoRI bővítéssel bíró és másik végén 3*T gyökkel, tompa véggel befejeződő 1480 6p értékű fragmentuma, egy 5700 bp értékű fragmentum Xbal helyének DNS-polimcráz általi helyreállítása után kapott 5700 bp értékű, pMC200-ból kapott Xbal-EcoRI fragmentummal fuzionálva. 8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adw szerotípusú Dane-részecskékből kivont HBV DNS-ből származó BamHI-fragmentumot viszünk fúzióba a regulátor szakasszal. 9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ayw szerotípusú Dane-részecskékből kivont HBV DNS-ből származó BamHI-fragmentumok fuzionált párjából kapott Hhal fragmentumot viszünk fúzióba a regulátor szakasszal. 10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy előzőleg pBR322 plazmidba inszertált Ilind Ill-fragment nmol alkalmazunk. 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Bamlll-fragmentumot a regulátor szakasz BglII-helyére inszertáljuk. 12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Ilhal-fragmcnfumol pMC200 olyan 1480 bp értékű fragmentumának Xbal helyénél visszük fúzióba a regulator szakasszal, amely fragmentum a regulátor szakaszt tartalmazza és egyik végén EcoRI bővítése van, a másik végén egy 3' T-csoportban végződik, s a pMC200-nak az 5700 bp értékű fragmentum Xbal-helyének polimerázzai való helyreállítása után kapott 5700 bp értékű Xbal-EcoRI fragmentumával fuzionálva van. 13. Eljárás HBsAg kódolására és élesztőgombában kifejeződésre képes nukleotid szekvenciát tartalmazó rekonibináns DNS molekulát tartalmazó élesztő-vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely I —12. igénypont szerint előállított rekonibináns DNS molekulát valamely élesztőgomba vektorba inszert álunk. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely a HBsAg-inszertumot és a regulátor szakaszt tartalmazó HindlII-fragmentumot Ilindlll-val kezelve felszabadítunk, cs az így kapott 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
