196613. lajstromszámú szabadalom • Eljárás előnyösen színes-poliakrilamidgélgyöngyök mikroszuszpenziós polimerizációs úton történő előállítására
1 196 619 2 A találmány tárgya új, mikroszuszpenziós polimerizációs eljárás, előnyösen színes poliakrilamid kopolimer gélgyöngyök előállítására. Mint ismeretes, a radioimmunoassay (RIA) egyik legkritikusabb lépése az antitesthez kötött és szabad ligandum elválasztása. Ezért már néhány évvel a radioimmunossay megjelenése után bevezették az első, úgynevezett szilárd fázisú eljárásokat. Ezen eljárás értelmében az antiszérumot Scphadex G-25 dextrán gélhez, polisztirolhoz, cellulózlroz vagy teflonhoz kapcsolták (Biochem. J. 100, 3IC/1966/, Biochim. Biophys Acta 130, 257 119661). A 4,455,411 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban nagy molekulasúlyú acrylamid polymerek előállítását ismertetik perszulfát, formaldehyd nátrium szulfoxylat és 2,2'-azobis 2-amidono-propán iniciátorok felhasználásával. Hasonlóképpen nagy porozitású gyöngypolimer (20-800 pm) előállítását közli a DE 34 04 021 A1 német szabadalmi leírás. Ezeknek a nagy szemcseméretű imniunanyaglrordozóknak az volt a hátránya, hogy az inkubációs elegyben gyorsan ülepednek, melynek a megakadályozására a reakcióelegyet tartalnrazó műanyagcsövet az inkubációs idő alatt rotálni kellett. A DE 32 24 484 A1 sz. NSZK-beli szabadalmi leírásban acrolein típusú vegyületek szuszpenziós polimerizációjával, megfelelő tenzidek jelenlétében fluoreszkáló vagy magnczitálható mikrogyöngyőket. állítanak elő. A mikrogyöngyök a radioimmunoassay körülményei között nem használhatók, mivel túlságosan apró szemcseméretük (0,03 — 80 pm) folytán az izotóp laboratóriumban használatos centrifugák segítségével nem ülepíthetők. A DE 31 06 456 A1 sz. német szabadalmi leírásban főleg enzimek immobili/.álására alkalmas szilárd hordozó gyöngypolimerizációs előállítását ismertetik. A DE 31 24 454 A1 sz. leírás vizes közegben, elsősorban fiziológiás folyadékokban abszorpciós célokra felhasználható polimerek előállítását közli. Állítottak elő olyan szemcseméretfí, az inkubációs idő alatt gyakorlatilag nem ülepedő poliakrilamid gyöngyöt, melynek alkalmazásával a rotálást mellőzni lehetett, és az inkubálást követően az antitesttel bevont gélszemcsék centrifugál ássál ülepíthetők voltak (GIT-Labor Medizin 2/81). Az eljárás, bár az előzőekhez képest számos előnynyel rendelkezik, lényeges hátránya, hogy a centrifugálás után a kis mennyiségű gél a kémcső alján alig látható, így a feliilúszó leszívásakor a gél és ezzel egyidejűleg a hozzákötött immunanyag kisebbnagyobb hányada elvész. Ezt a hátrányt kísérelte meg kiküszöbölni a 4 108 974 sz. Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás, amely néhány esetben megkísérelte a poliakrilamid festését úgy, hogy a már elkészült akrilamid polimert utólag festették meg egy bizonyos „Alciair’-kék, illetve „Alcian”-sárga nevű festékkel. Ez a festék a poliakrilamidhoz fizikai úton kötődik, a felületen adszorbeálódik, ami azzal a hátránnyal jár, hogy bizonyos külső hatásokra a felületről könnyen el is távolítható. Az akrilamid polimer színének eltűnése bekövetkezhet az alkalmazás során is. Ugyanez a hátránya a DE 26 52 646 sz. leírásban ismertetett eljárásnak, mely szerint a gyöngyök színezésére ftalocianin vagy kadmium vegyiileteket alkalmaznak. A fent ismertetett módszerek noha többé-kevésbé elérték a kívánt célt nem, vagy nem biztos, hogy rendelkeznek mindazokkal az előnyökkel, melyeket kidolgozásuk során célul tűztek ki. így pl. az utólagos színezés jelentős mértékben módosíthatja a gélgyöngy határfelületi tulajdonságait miáltal lényegesen megváltozhat a kötőképessége. Bizonyos — nem túlságosan poláris — színezékek hatására megváltozhat a rendszer kolloid stabilitása, ezáltal éppen azt az előnyt veszíthetjük el, amelyet a mikrogyöngy alkalmazása kínál, ti. azt, hogy hosszú ideig diszpergált állapotban levő mikrogyöngyöket tartalmazó rendszer — a hordozó nagy fajlagos felületé és a jó hozzáférhetőségi viszonyok miatt — közel homogén fázisú reakció körülményeket teremt, mégpedig úgy, hogy a szilárd hordozóhoz kötött reakciópartner a hordozóval szükség esetén különböző, viszonylag könnyén kivitelezhető módon eltávolithaíóvá válik. Találmányunk célja,hogy meglehetősen általánosan alkalmazható, könnyen és olcsón kivitelezhető eljárás megvalósítása, amelynek során akrilamidból, (érliálósító esetleg más komonomerek, mint pl. akrilsav segítségével egy, vagy két lépésben színes gélgyöngyöket állítunk elő előnyösen a 3—50 pm mérettartományban. Az így készített színes géigyöngyök a felhasználás során a beállított szín intenzitását hosszú ideig megőrzik és a színező anyag nem gyakorol észrevehető befolyást a felület kötőképességérc és a gyöngyök kolloid stabilitására. További követelmény, hogy a festett gél jól észlelhető színű legyen, a színezésre alkalmazott pigment a Rí A körülményei között színét ne változtassa és ne oldódjék az alkalmazott pufferben, — a festés ne befolyásolja az antis/.érum gélgyöngyöliöz való kötését, — az alkalmazott festék ne rontsa a gélhez kötött antitestét és a folyadékfázisbau levő antigén kötési tulajdonságát. Azt találtuk, hogy a fenti követelmények teljesítésére számos pigment alkalmas, azonban a lehetséges pigmentek közül legjobban a berlini-kék felel meg, mivel színe, oldhatósága és kémiai stabilitása a fenti kívánalmaknak megfelel. A találmány alapját azok a felismerések képezik, hogy akrilamid, akrilsav és N.N'-bisakrilamid vizes oldatban iniciált polimerizáciőja során a vizes monomer oldathoz 8-10 pM átmérőjű részecskéket tartalmazó berlini-kék szolt adva folytathatjuk le a heterogén fázisú polimerizációl, amelynek során a színező anyag kolloid részecskéi a térhálós rendszerben imrnobilizálva maradnak (egy lépéses eljárás). Eljárhatunk úgy is, hogy az önmagában ezekre a monomerekre már ismert mikroszuszpenziós eljárással színtelen gélgyöngyöt állítunk elő, majd ezt - utólag — mégpedig a berlini-kék kolloid gélgyöngyben való előállításával színezzük (két lépéses eljárás). Közelebbről azt találtuk, hogy abban az esetben egyrészt, ha a színezést még a poiimerizációí megelőzően a monomerek elegyítésekor végezzük, másrészt, ha a színezést ugyan utólag végezzük, azonban olyan megfelelő kolloidális színezőanyagot alkalmazunk, amely ugyan fizikai úton, de irreverzibilisen kötődik, beépül a polimer térhálójába (immobizálódik), onnan többé nem diffundái ki, az immunanyagnak az immunszorbens felületéhez való kapcsolódását nem zavarja, akkor eleget tehetünk a fenti 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
