196464. lajstromszámú szabadalom • Új eljárás 1,2-dehidro-szteroidok előállítására
4 196464 5 A találmány szerinti eljáráshoz bármely ismert 1-dehidrogénezó mikroorganizmus felhasználható. Az 1-dehidrogénezó baktériumokat Bergey: Manual of Determinative Biology (8. kiadás) szerint két csoportra oszthatjuk. Az általunk leirt eljárás sikeresen alkalmazható az Arthrobacter és Corynebacterium fajokra, és azokra a törzsekre, amelyeket a 17. rész .Actinomycetes és hasonló mikroorganizmusok" cimszó alatt tárgyal. Más törzsek 1-dehidrogénezó fajai, mint a Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces és Bacterium is alkalmasak az eljárás megvalósításéra. Eljárásunkat két, mindenki által hozzáférhető szteroidokat 1-dehidrogénezö hatású mikroorganizmuson mutatjuk be. Egyrészt a 3 065 146 számú USA-beli szabadalmi leírásban 1-dehidrogénezöként szereplő Bacterium cyclooxydans-t (ATCC száma 12673) vizsgáltuk. A 2 837 464 számú USA-beli szabadalmi leirásban szereplő Arthrobacter simplex (ATCC száma 6946) mikroorganizmust gyakrabban használják szteroidok 1-dehidrogénezésére. Ezért a leírás legnagyobb részében ezt a mikroorganizmust használjuk a találmány szerinti eljárás ismertetésére. De felhívjuk a figyelmet, hogy bármely 1-dehidrogénezó mikroorganizmus alkalmas a találmány szerinti eljárás végrehajtására. A mikroorganizmusokat a kővetkező öszszetételű táptalajon tenyésztettük: a) szervetlen vegyületek (nitrátok vagy ammónium-sók) vagy szerves nitrogéntartalmú vegyületek (élesztő extraktum, pepton, gabonaáztatólé) a növekedéshez szükséges nitrogén biztosításéra, b) szén- és energiaforrások, például szénhidrátok és cukorszármazékok, olaj, zsirsavak és metil-észtereik, alkoholok, aminosavak vagy szerves savak, c) ionok és nyomelemek (nátrium, kálium, magnézium, foszfát, szulfát, manganát, réz, kobalt, molibdén) olyan mennyiségben, amely a csapvizben vagy a kevésbé finomított közegként használatos anyagokban található. A mikroorganizmusok növekedésükhöz oxigént igényelnek a felettük lévő légtérben. Az A. simplex növekedéséhez megfelelő hőmérséklet 10-45 °C, előnyösen 28-37 °C. A növekedéshez optimális pH-érték semleges körül van. A sejteket szteroid-l-dehidrogénezésre úgy aktiváljuk, hogy l,2-telitett-3-keto-szteroidot, például androszta-4-én-3,17-diont vagy. kortizon-acetátot adunk 0,005 t/v%, vagy nagyobb mennyiségben a közeghez. Az indukálószer jelenlétében a sejteket 6 órán keresztül inkubáljuk, majd összegyűjtjük és szárítjuk őket. Az indukálószer a növekedési ciklus bármely pontján hozzáadható a mikroorganizmusokhoz. A disznózsír-olajhoz (triglicerideket és szabad zsírsavat tartalmazó olaj) hasonló táptalajon tenyésztett kultúrák a szteroid-l-dehidrogenázt gyorsan kezdik szintetizálni, míg a glükózon tenyésztett mikroorganizmusok csak a szubsztrátum elfogyasztása után kezdenek enzimet termelni. Az inkubálást 6 vagy még több órán keresztül folytatjuk az indukálószer hozzáadása után, majd a sejteket begyüjtjük az oldószeres folyamatban való használat vagy szárítás céljából. »A sejteket szárítás céljából elkülönítjük a táptalajtól, és hagyományos módszerek, például centrifugálás, flokkuáltatás, • szűrés vagy ultraszűrés segítségével koncentráljuk őket. Az elválasztott sejteket ezután csökkentett nyomáson 1-85 °C, előnyösen 55- 75 °C hőmérsékleten meleg levegővel porlasztva, vagy forgatva szárítjuk, amíg az anyag nedvességtartalma 1-10%, előnyösen 5% nem lesz. A biokonverzióhoz használt sejteket 5 °C-on tároljuk. Aktiv szárított sejteket standard módszerek segítségével állíthatunk elő a szárított sejtek immobilizélásával például úgy, hogy poliakril-amid gélbe zárjuk vagy egy polielektrolit hordozóanyaghoz kollagén vagy kovalens kötéssel kötjük őket (Methods in Enzymology, XLIV. kötet, Academic Press Inc., New York, 11-317. oldal /1976/). A biokonverziót az elkészített sejtek és a szteroid szubsztrát egymásra hatása révén érjük el. Általában a sejteket és a szteroidot egy gyengén pufferolt 6-10, előnyösen 7,25- 8,5 pH-jú vizes közegben szuszpendáljuk. A sejtkoncentráció 0,1-50 g/1, a szteroid és a sejtek tömegaránya 0,05-5. Vizes közegben 8- 10 g/1 sejt-, illetve 5-10 g/1 szteroidkoncentráció előnyös a biokonverzió végrehajtásához. Katalitikus mennyiségű exogén elektron átvivő anyagot (például 5 x 10~* mól menadiont) is adunk a reakcióelegyhez. Katalizátorként menadiont (2-metil-l,4-naftokinon), fenazin-metoszulfátot, diklór-fenil-indofenolt, 1,4-naftokinont, menadion-biszulfitot, ubikinonokat (Koenzim Q) és K-vitamin típusú vegyieteket használhatunk. Az elegyeket 0-14 napon keresztül 5-45 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás alatt az elegyben felesleges mennyiségű molekuláris oxigénnek kell lennie, ezért előnyösen keverjük. Az 1-dehidrogénezés sebessége általában az idővel csökken. A biokonverzió 10 g/1 szubsztrát alkalmazásával kevesebb, mint 24 óra alatt 98-100%-os lehet. Az eljárást a következő módokon hajthatjuk végre: a) A szteroidot és menadiont gyengén pufferolt vizes oldatban szuszpendáljuk, majd a szárított sejteket hozzáadjuk. A Tweewn 80- hoz hasonló felületaktív anyagok is hozzáadhatok az elegyhez 0-5% koncentrációban. b) A sejteket vizes pufferoldatban szuszpendáljuk, majd a metanolban, etanolban, acetonban (amely térfogata nem lehet több, mint a végtérfogat 5%-a) oldott elektron átvivő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
