196462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás imun interferon előállítására

8

196462

9

1. táblázat

Immunizált egerek aritipeptid-antitest titere

B/T (%)

Az egér száma

Első immunizálás 1/

Második immunizálás 2/

Harmadik immunizálás 3/

*-1- 4/

N.D.

24.5

2

N.D. 5/

19.3

35.3

3-N.D.

24.7

4

N.D.

1.3

1.7

5

N.D.

1.8

5.0

6

normál

N.D.

0.8

egér

0.6

0.1

N.D.

1/ Szérum higités aránya: 1/1000

2/ .Szérum higitós aránya: 1/6300

3/ Szérum hígítás aránya: 1:7800

4/ -: nem kimutatható

5/ N.D.: nem határoztuk meg

B/T: (kötött enzim aktivitás/teljes hozzáadott

enzim aktivitás) x 100

EIA-módszer

A 2. példa szerint előállított fehérje- ^ komplexei immunizált egerek szérumában vagy a hibrodoma felülúszóban levő antitest-aktivitást EIA-módszerrel határozzuk meg. (Immunology 1, 3 /1978/.1. A szérumot vagy a hibridoma felülúszót A-pufferrel (20 mM g- Na2HP04, 100 mM NaCl, 0,1% NaNa, 1 mM MgCk, pH 7,0) hígítjuk, majd a hígított elegy 100 pl-es részletét 100 pl enzimhez kötött polipeptid-származékkal (2. példa) elegyítjük és a reakciót 24 °C-on 24 órán ét folytatjuk, Ezután 100 pl 3%-os, nyúl anti-egér IgG-vel kapcsolt cellulózt adunk hozzá és a reakciót 24 °C-on 4 órán át folytatjuk. A reakció befejeződése után a cellulózt 0,5% Tween 20-t tartalmazó A-pufferrel alaposan mossuk, majd 45 500 pl 20 pg/ml-es 4-metil-umbelliferi-/j-D-galaktozidot adunk hozzá. A reakciót 37 °C- on 2 órán át végezzük, majd 3 ml 100 mmólos karbonát-puffer (pH 10,5) hozzáadásával leállítjuk. A fluoresszencia intenzitást fluoromé- 50 térré mérjük, (gerjesztés 365 nm; emisszió 450 nm).

4. példa 55

Sejt-fúzió

A 3. példában leirt végső immunizálás után három nappal a y-2 egér lépét kivág- 60 juk, rozsdamentes szűrőn nyomás alatt átszűrjük és Eagle-féle minimális esszenciális közegben (MÉM) szuszpendáljuk. Ily módon lép-sejt szuszpenziót nyerünk. A sejt-fúzióhoz BALB/C egérből származó P3-x63.Ag8.Ul 05

(P3U1) mieloma-sejteket alkalmazunk. (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1 /1978/). A sejtfúziót Köhler és Milstein eredeti módszerével végezzük el (Nature 256, 495-497 /1975/). A lépsejteket és P3U1 sejteket külön-külön szérum-mentes MEM-el háromszor mossuk és 5 : 1 arányban (a sejtek számában kifejezve) összekeverjük. Az elegyet 800 fordulat/perc sebességgel 15 percen ót centrifugáljuk, ezalatt a sejtek kiülepednek. A felül elhelyezkedő folyadék alapos eltávolítása után az üledéket enyhén fellazítjuk, 0,3 ml 45%-os polietilén-glikol (PEG) 6000-t (Koch) adunk hozzá és az elegyet 37 °C-on meleg víztartályban 7 percen át állni hagyjuk, mikoris a sejtfúzió lejátszódik. Ezután 2 ml/perc sebességgel MEM-t adunk hozzá. Az összesen 12 ml MÉM hozzáadása után kapott elegyet 600 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd a felül elhelyezkedő folyadékot eltávolítjuk. A sejt-üledéket 10% magzati borjú szérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajban

(RPMI164U-10FCS) szuszpendáljuk 2 x 105 P3U1 sejt/ml koncentrációban és 24-mélyedéses multi-csészékben (Linbro) levő 144 mélyedést 1 ml szuszpenzióval beoltunk. A beoltás után a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó inkubátorban 37 °C-on inlcubáljuk. 21 óra elteltével HAT-szelektív tenyésztést indítunk meg oly módon, hogy HAT-tal (1 x IO-4 M hipoxantin, 4 x 10‘7 M aminopterin, 1,6 x 10'5 M timidin) kiegészített RPMI1640-10FCS táptalajt adunk hozzá, 1 mi/mélyedés mennyiségben. A HAT-szelektív tenyésztést folytatjuk, miközben a starttól számított 3, 5. és 7. napon 1 ml régi tenyészetet 1 ml HAT-közegre cserélünk le. A hibridómák növekedését a sejtfúzió után 10-14 nappal figyeljük meg. Mihelyt a fermentlé színe sárgába megy át (kb. 1 x 106 sejt/ml) a felülúszót összegyűjtjük és az anti-test jelenlétében az EIA-módszerrel megvizsgáljuk. A fenti módon 144 olyan mélyedést vizsgálunk meg, amelyben hibridoma növekedést megfigyeltünk. Két mélyedésben (y 2-11 és y

6