196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
12 196461 13 5. példa Klónozás Három mélyedésből (^2—11, *2-62 és *2- -100) származó, pozitív antitest-aktivitást mutató mélyedésből származó hibridómákat a határhigitásos módszerrel klónozunk. A hibridóma sejteket RPMI 1640-20FCS-ben legalább 2 hibridóma sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk és a szuszpenziót 96-mélyedést tartalmazó mikrolemez mélyedései között 0,1 ml részletekben elosztjuk. A fenti elosztásban tápsejtként minden mélyedéshez 5xl05 BALB/C egér timocitát adunk. A fentiek eredményeként a sejtburjánzás kb. 2 hét múlva figyelhető meg. A felülúszót összegyűjtjük és az antitestek jelenlétét a 3. példában leírt EIA-módszerrel meghatározzuk. Antitest aktivitást tapasztalunk *2-11 mélyedés 19 kiónja közül 8-ban, a *2-62 mélyedés 54 kiónja közül 3-ban, és a *2-100 mélyedés 47 kiónja közül 5-ben (2. táblázat). 2. táblázat Klónozott hibridómák anti-peptid antitest aktivitása Hibridóma száma B/T (%) *2-11 i 68 2 31 3 63 6 68 7 67 9 69 12 42 18 60 *2-62 14 20 16 21 34 16 *2-100 2 69 3 70 16 56 25 80 46 33 Hiperimmun egér szérum 35 6. példa Monoklonális antitestek IFN-y-hez való kötődési kapacitása A monoklonális antitestek IFN-*-hez való kötődési kapacitását az alábbi módszerrel ha -tározzuk meg. Nyúl anti-egér IgG antitesttel kapcsolt cellulóz 3%-os oldatához (300 ul) a *2-11, *2-62 és *2-100 sejtek 3 klónozott sejtvonal tenyészetének felülúszóját (300 m 1) adjuk és a reakciót szobahőmérsékleten 12- -20 órán ót folytatjuk. A cellulózt ezután fiziológiai konyhasó-oldattal alaposan mossuk és az alábbi eljárással nyert IFN-*-ból 550 E/ml-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az alábbi eljárással nyert IFN-*-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az IFN-* aktivitást a citopatikus hatás (CPE) leolvasó módszerrel mikrolemez felhasználásával meghatározzuk. [Applied Microbiology 16, 1706 (1968)1. 96 mélyedést tartalmazó mikrolemez minden mélyedésébe 50 /ul MEM-t helyezünk és az első mélyedésbe 50 jul IFN mintát adunk, majd kétszeres sorozathígítóst alkalmazunk. Minden mélyedéshez 50 ni WlSH-féle sejt-szuszpenziót (4xl05 sejt/ml) adunk 20% FCS-t tartalmazó MEM-ben és az inkubálást szén-dioxid gáz inkubátorban 37 °C-on 24 órán ót folytatjuk. Ezután minden mélyedéshez 2000TCID50 (TCIDso = közepes sejttenyészet fertőző dózis) koncentrációra beállított 50 ni vesiculáris stomatitis virus (New Yersey törzs) készítményt adunk és az inkubálást szén-dioxid inkubátorban 37 °C-on folytatjuk. Mintegy 35 óra elteltével, amikor az IF’N mintát nem tartalmazó mélyedésben levő sejtek 100%-os CPE-t mutatnak, minden mélyedést a CPE meghatározása céljából mikroszkopikusan megvizsgálunk és az 50%-os CPE-t mutató mélyedésben levő IFN-minta higitási faktorának reciprokát tekintjük IFN-titernek. IFN-* minta gyanánt a humán perifériális limfociták 40 ng/ml concanavalin A-val és 15 ng/ml 12-0-tetra-dekanoil-forból-13-acetáttal történő stimulólósa után 72 órával öszszegyűjtött felülúszót alkalmazunk. A fenti felülúszó tenyészet minden ml-e 4400 egység humán IFN-*-t (hővel és savval szemben labilis) tartalmaz. Ha az IFN-*-hoz kötődő kapacitást mutató antitestek vannak jelen a klónozott sejt-tenyészet felülúszóban, úgy a hozzáadott IFN-*-nak a cellulózon az antitestekhez kell kötődni és a felülúszó IFN-*-aktivitásának csökkenni kell. A *2-11 klón esetében az IFN-*-vaJ való viszonylag intenzív kötődő kapacitása figyelhető meg és a hozzáadott IFN-* (500 E/ml) 50-75%-a az antitestekhez kötődik (3. táblázat). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
