196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
8 196461 9 sókat és/vagy puffereket) tartalmazhatnak. A parenterális adagolásra alkalmas készítmények intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziós vagy injekciós oldatok lehetnek. Ezek a készítmények további, szinergista kölcsönhatásba nem lépő gyógyászati hatóanyagokat is tartalmazhatnak. A parenterális készítményekhez a gyógyszergyártás önmagukban ismert módszerei szerint további adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló- vagy emulgeálószereket, puffereket stb.) is adhatunk. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük. 1. példa Antigénként használt hordozófehérje-polipeptid komplex szintézise A H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH polipeptidet thyro-globulinnal (a továbbiakban TG) kapcsoljuk Goodfriend és társai módszerével [Science 144, 1334 (19641J. Magát a peptidet szokásos peptid-szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő. A szilárdfázisú és folyadékfázisú módszert egyaránt felhasználhatjuk, bár sok esetben a folyékony fázisú szintetikus módszer előnyös. Megfelelő peptid-szintéziseket pl. az alábbi irodalmi helyek Írtak le: Schröder és Lübke: .The Peptides', Vol. 1. Academic Press, New York, USA, 1966; vagy Izumiya és társai: .Peptide Syntheses', Maruzen, Tokyo, Japan, 1975; vagy Haruaki Yajima: .Experiments in Biochemistry', Vol. 1. 207-400 oldalak, Tokyo Kagaku Dojin, 1977. E módszerei; közül - többek között - az azidos, kloridos, savanhidrides, vegyes savanhidrides, DCC és aktív észteres módszereket, a Woodward K.-reagenst felhasználó módszert, a karbodiimidazolos módszert, az oxidációs-redukciós módszert és a DDCC/addiciós (pl. HONB, HOBt, HOSu) módszert említjük meg. Az IFN-v 131-146. fragmensének részletes előállítása a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban került ismertetésre. 2,5 mg fenti polipeptidet 3,75 mg TG-vel összekeverünk, majd 2 ml 50 millimólos foszfát-puffért adunk hozzá és az elegyet jegesvízben erőteljesen keverjük. Ezután fokozatosan 30,4 mg karbodiimid-hidroklorid és 200 ml desztillált viz oldatát csepegtetjük hozzá. A reakció befejeződése után desztillált vízzel szemben 24 órán át dializáljuk, majd iiofilizáljuk. 4,7 mg fehérje-komplexet kapunk. 2. példa Enzimhez kötött antigén előállítása az enzim immunológiai meghatározáshoz IETA) az antitest kimutatásához Az EIA számára az enzimhez kötött antigént Kitagawa és tsai módszerével állítjuk elő [Journal of Biochemistry 79, 233 (1976)]. (i) A maleiinido-csoport bevitele a polipeptidbe. Az 1. példa szerint előállított polipeptidet (350 nmól) 1 ml 100 mmólos foszfát-pufferben oldjuk (pH 6,8) és az oldatot 585 pg (1,75 pmól) N-(4-karboxi-ciklohexil-metil)-maleimid N-hidroxi-szukcinimid-észternek 70 pl N,N-dimetil-formamiddal képezett oldatához adjuk. Az elegyet 30 °C-on 30 percen át keverjük. A reakció befejeződése után Sephadex G-25 oszlop felhasználásával kromatografálva 185 nmól, bevitt maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid frakciót kapunk. (ii) A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid ű-D-galaktozidázzai történő kapcsolása. A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptidet (16,5 nmól) 3,3 nmól ß-D-galaktozidázzal elegyítjük. A reakciót 4 °C-on 18 órán át végezzük, majd 412,5 nmól ß-merkapto-etanol hozzáadásával leállítjuk. A /i-D-galaktozidázzal kapcsolt polipeptidet Sepharose 6B oszlopon frakcionáljuk és a további kísérletekben felhasználjuk. 3, példa Immunizálás 6 db 7-8 hetes BALB/C egeret 40 pg (fehérjében kifejezve) az 1. példa szerint előállított fehérje-komplex mint antigén Freund-féle teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután inokulálunk (primer immunizálás). A primer immunizálás után két héttel az egereket a fentivel azonos dózisú antigén Freund-féle nem-teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékevei szubkután ismét inokuláljuk (szekunder immunizálás). További két hét elteltével a második immunizálással azonos módon harmadik immunizálást hajtunk végre. A harmadik, immunizálás után 6 nappal az egerekből részleges vérmintát veszünk es a szérum-antitest litereket az alábbiakban ismertetésre kerülő ElA-módszerrel meghatározzuk flásd: Immunopharmacology J, 3 (1978)1. A legmagasabb antitest-literi mutató >—2 számú egeret 120 pg antigén 0,5 ml vizes nátrium-kloriddal képezett oldatának intravénás inokulálásával végső immunizálásnak vetjük alá. Az egyes egerek antitesl-tiler adatait az 1. táblázatban foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 C
