196461. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immun interferon előállítására és tisztítására, valamint ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
196-161 o találtuk, hogy a tisztított készítmény többfajta különböző molekulatömegű fehérje-speciest tartalmaz. Aminosav-szekvencia meghatározás segítségével azt találtuk, hogy e fehérje speciesek ténylegesen az immun interferon intakt szekvencia formájának az intakt szekvencia fehérje számos fragmensévál képezett kombinációi. Meglepő módon, bár felismerésünk szerint az ismert keverék az intakt immun interferon fehérjét és fragmenseit egyaránt tartalmazza, azt találtuk, hogy e keverék egyik komponense biológiai aktivitását nyilvánvalóan megtartja. Az rlFN-Tf extrakcióját szonifikáció vagy kémiai lízis útján végezhetjük el. Az rIFN-v (ennek DNS bázis szekvenciáját és aminosav szekvenciáját az 1. sz. irodalmi helyen Írták le.) a szonifikációs vagy kémiai iizis útján történő extrakciós lépésnél lebomlik. A fagyasztott sejtek szonifikációja során elsősorban 15K rlFN-'x keletkezik (azaz a 132-146. sz. C-terminális aminosavak eltávolítása útján létrejött rlFN-y). Ezt a lebomlást olyan extrakciós reagensek (pl. guanidin-hidroklorid) felhasználásával akadályozhatjuk meg, amelyek az extrakció körülményei között az rlFN-')} biológiai aktivitását vagy aminosav szekvenciáját nem befolyásolják. Azt találtuk továbbá meglepő módon, hogy az immun interferon a guanidin-hidrokloriddal végzett extrakciós lépés után biológiai aktivitását megtartja annak ellenére, hogy a tisztított immun interferon készítményhez adott guanidín-hidroklorid a biológiai aktivitást lerontja. Találmányunk rekombináns humán immun interferon intakt és teljes szekvencia formájának előállítására vonatkozik. Ezt a fehérjét valamely azt tartalmazó transzformált mikroorganizmusból olyan reagenssel (vagy reagens-eleggyel, pl. guanidin-hidrokloriddal, egy fehérje denaturáló szerrel) történő kezeléssel nyerjük, amely feltételezésünk szerint az extrakció alatt a proteáz-enzim-aktivitást gátolja, ugyanakkor azonban az extrakció körülményei között a kívánt fehérje aktivitását nem befolyásolja. A tisztított rlFN-jj-t végül oly módon nyerjük, hogy az extrakciónál kapott felülúszót - előnyösen megfelelő higitás után - közvetlenül tisztításnak vetjük aló, éspedig előnyösen monoklónális anti-test-oszlopra visszük fel. Ezek az extrakciós és tisztítási eljárások nagymé- X retű termelés céljainak megfelelően automatizálhatok. így találmányunk segítségével először állítható elő nagy mennyiségű homogén iTFN-'i' és nyílik ezáltal lehetőség kiterjedt 5 klinikai vizsgálatok, biológiai kísérletek, röntgen-krisztallográfiós és szerkezet-funkciós vizsgálatok elvégzésére. A találmányunk szerinti eljárásnál anti-proteolitikus ágensként bármely guanidini- 10 um-sót felhasználhatunk, Guanidium-sóként pl. szerves savakkal (mint pl. ecetsavval) vagy ásványi savakkal (pl. hidrogén-halogenidekkel, mint pl. hidrogén-bromiddal, sósavval, hidrogén-fluoriddal vagy jód-hidrogén- 15 savval) képezett sókat alkalmazhatunk. Különösen előnyösnek bizonyult a guanidin-hidroklorid. A mikroorganizmus kezelésénél a guanidinium-só koncentrációja nem döntő jelentőségű tényező és bármely hatásos meny- 20 nyiségben felhasználhatjuk. Előnyösen járhatunk azonban el oly módon, hogy a mikroorganizmusokat a guanidinium-só 3-7 mól/liter koncentrációjú oldatával kezeljük és lg transzformált mikroorganizmushoz kb. 3-9 25 térfogat só-oldatot használunk. A só koncentrációját oly módon állíthatjuk be, hogy megfelelő oldószerrel (pl. ammónium-acetáttal, piridin/ecetsav eleggyel, stb.) oldatot készítünk. A szakember számára nyilvánvaló, hogy 30 találmányunk értelmében más proteáz-inhibitor reagensek is felhasználhatók (pl. karbamid vagy tiocianát). Eljárásunk további részleteit és előnyös foganatositási módjait az alábbi leírásban és 35 példákban ismertetjük. Az E. coli által termelt rekombináns humán interferont előnyösen fagyasztott sejt-pépból 7 mól/liter koncentrációjú guanidin-hidroklorid-oidattal extrahálhatjuk és eló- 40 nyösen új monoklónális anti-test affinitás oszlopon tisztíthatjuk. A 18 000 dalton (18K; SDS-PAGE szerint) látszólagos molekulatömegü tisztított interferont guanidinnel nyerjük, mig az alacsonyabb molekulatömegü speciest 45 (a fő species molekulatömege kb. 15 000 dalton, 15K) guanidines exti-akció nélkül végzett szonifikálással izoláljuk. Mind a 18K, mind a 15K fehérje amino-terminális szekvenciája a humán immun interferon fehérje a DNS kódo- 50 lósa alapján várható szekvenciának felel meg. A 18K immun interferon leírásban használt DNS szekvenciája az alábbi képletnek felel meg: AGGAGGAATTC ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG V
