196457. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferonok előállítására
10 196457 11 10% FCS (magzati borjúszérum), hőkezeléssel inaktivált, 25 mM HEPES puffer (N-/2-hidroxi-etil/-piperazin-N’-/2-etén-szulfonsav/), 50 pg/ml gentamicin. Hetenként két alkalommal altenyészetet készítünk 1-3 részre osztással. A fenti táptalajon termelt sejteket 10% dimetil-szulfoxid hozzáadása után megfagyaszthatjuk. A KG-1 sejtvonal CRL 8031 számon lett deponálva az American Type Culture Collection (ATCC) mikroorganizmus-gyűjteményben. A KG-1 sejteket Sendai vagy Newcastle kór vírusával indukáltuk leukocita interferon mRNS termelésére Rubinstein és munkatársai módszerével (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76', 640-644 /1979/). A sejteket az indukálás után 5 órával gyűjtöttük össze, és a ribonukleinsavat a guanidin-tiocianát/guanidin-hidrokiorid eljárással különitettül el (Chirgwin és munkatársai, Biochemistry, 18, 5294-5299 /1979/). Hasonló módon különítettük el a ribonukleinsavat az indukálatlan sejtekből. Öli— go(dezoxitimidin) (dT) - cellulóz kromatográfiát és változó szacharóz-koncentrációjú (szacharóz-grádiens) ultracentrifugálást alkalmaztunk a poli(A) mRNS 12S frakciójának elkülönítésére a Green és munkatársai (Arch. Biochem. Biophys., 172, 74-89 /1976/1 valamint Okuyuma és munkatársai (Arch. Biochem. Biophys., 188, 98-104 /1978/) által leírt módon. Az így kapott mRNS interferontitere 8000-10000 egység/pg volt a Xenopus laevis oocyta vizsgálatnál (Cavalieri és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 3287-3291 /1977/). C. A LelF cDNS szekvenciákat tartalmazó tenyészetek készítése 5 5 pg mRNS-ből hagyományos módon készítettünk kétszálú cDNS-t (Wickens és munkatársai, J. Bioi. Chem. 253, 2-183-2495 /1978/ és Goeddel és munkatársai, Nature, 281, 544- 548 /1979/). A kiegészítő DNS-t a méret alapján frakcionáltuk 6%-os poliakrilamid gélen végzett elektroforézissel, és 230 g mennyiségű, 500-1500 bázispár méretű anyagot különítettünk el elektroelúcióval. E kiegészitó dezoxiriboruikleinsav (cDNS) 100 ng részét dezoxieitidin (dC) farokkal láttuk el Chang és munkatársai szerint (Nature, 275, 617-624 /1978/), 470 ng pBr322 plazmiddal (ATCC 31 344) - amelyre a Pst I helyen dezoxiguanozin (dG) farkakat vittünk fel - kapcsoltuk össze (Bolivar és munkatársai, Gene, 2, 95-113 /1977/), és felhasználtuk az Escherichia coli x 1776 törzs transzformálására. Hozzávetőleg 130, tetraciklinre rezisztens, ampicillinre érzékeny, transzformált terméket kaptunk 1 ng cDNS-re vonatkoztatva. Egy második hasonló kísérlet során mintegy 1000, tetraciklinre rezisztens, ampicillinre érzékeny, Escherichia coli K-12 294 törzsből transzformált terméket kaptunk 1 ng cDNS-re vonatkoztatva. Ebben az esetben 600-1300 bázispár közötti méretű cDNS-t nyertünk ki a méret alapján történő frakcionálás után elektroelúcióval a dezoxicitidinnel való farokképzéshez. D. Szintetikus oligonukleotidok előállítása és felhasználása Az emberi leukocita interferon számos triptikus töredékében jelenlevő aminosavak szekvenciájának ismerete lehetővé tette a LelF mRNS különböző tartományait kiegészítő szintetikus dezoxioligonukleotidok megtervezését. A T-l és T-13 triptikus peptideket választottuk ki, mivel az aminosav-szekvenciájuk mindössze 12 illetve 4 undekamer szintézisét tette szükségessé az összes lehetséges kódoló szekvencia biztosításához (1. ábra). A dezoxioligonukleotid minták 4 sorozatát szintetizáltuk minden egyes szekvenciához. Ezek vagy három (T-1A, B, C, D) vagy egy (T-13A, B, C, D) oligonukleotidot tartalmaztak. A 11 bázisnak megfelelő hoszszúságú kiegészítő dezoxioligonukleotidokat a foszfortriészteres módszerrel vegyi úton szintetizáltuk (Crea és munkatársai, Proc. Nach Acad. Sei. ÜSA, 75, 5765-5769 /1978/). Négy mintát készítettünk a T-13 sorozatban. A tizenkét T-l mintát 3-3 mintából álló négy csoportban készítettük el, amint azt az 1. ábra szemlélteti. A T-13 sorozatba tartozó négy különálló mintát és a tizenkét T-l mintát felhasználtuk alaprészként radioaktiv izotóppal jelzett egyszálú DNS szintéziséhez. Ez utóbbi hibridizációs mintaként alkalmazható. A templát mRNS vagy a Sendai kór vírusával indukált KG-1 sejtekből kinyert 12S RNS (8000 egység interferonaktivitás per pg) vagy indukálatlan fehérvérsejtekből elkülönített teljes poli(A) mRNS volt (interferon-aktivitás < 10 egység per pg). 32P izotóppal jelzett kiegészítő dezoxiribonukleinsavat készítettünk ezekből az alaprészekből ismert reakciókörülmények alkalmazásával (Noyes és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, 1770-1774 /1979/). A reakciókat 60 pl térfogatban végeztük, 20 mM trisz-hidroklorid (trisz/hidroxi-metil/-amino-metán-hidroklorid) (pH = 8,3), 20 mM kálium-klorid, 8 mM magnézium-klorid és 30 mM béta-merkapto-etanol jelenlétében. A reakcióhoz 1 pg mennyiséget használtunk fel az egyes alaprészekből (azaz összesen 12 ug-ot a T-l sorozathoz és összesen 4 ugot a T-13 sorozathoz), továbbá 2 ug .indukált' mRNS 12S frakciót (vagy 10 pg indultála! lan poli(A) mRNS-t), 0,5 mM dATP-t, dCTP- t, dTTP-t, 200 pCi (alfa 32P) dCTP-t (Amersham, 2-3000 Ci/mól) és 60 egység fordított tnnszkriptázt (Bethesda Research Laboratories). 5 10 .5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
