196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
10 196456 11 hetők (immortalizálhatók) a találmány szerinti módszerrel. Ezáltal a találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy kívánt állati és emberi sejteket tenyésztésbe vegyünk, és ezen a módon azt a problémát is megoldjuk, hogy sejttermékeket, Így például antitesteket, alvadási faktorokat, enzimeket és egyéb, a sejt által szintetizált anyagokat in vitro állítsunk elő. Ugyanígy lehetővé teszik a találmány szerinti tenyészetek, hogy vegyianyagok vizsgálatára kísérleti állatokat növekvő mértékben nélkülözhetővé tegyünk. A találmány tárgyát képezi továbbá egy találmány szerinti eljárással előállított permanensen tenyészthető setjvonal alkalmazása sejttermókek, például monoklonális antitestek, alvadási faktorok, limfokinok, enzimek és egyéb, a proteinekhez vagy más anyagcsoportokhoz tartozó sejttermékek kinyerésére. A találmány ezen kiviteli alakja különösen permanensen tenyészthető B-limfociták monoklonális antitestek előállításéra való alkalmazásánál, permanensen tenyészthető endothel-sejtek, melanóma-sejtek, hepatociték, vesesejtek és hasonlók alvadási faktorok kinyerésére való alkalmazásénál, permanensen tenyészthető T-limfociták + B-limfociték vagy/és makrofágok limfokinok kinyerésére való alkalmazásánál, permanensen tenyészthető mirígysejtek esetében a mirigyekből kiválasztott termékek, így hormonok és hasonlók kinyerésére használható. Megállapítjuk, hogy a találmány szerinti immortalizálásra használt állati sejtek fajtájától függően minden érdekelt sejttermék kinyerhető, úgyhogy nem tűnik szükségesnek, hogy ezeket itt részletezve felsoroljuk. A- sejttermékek kinyerése azonban nem csak kiindulási sejtek termékeire, tehát homológ sejttermékekre korlátozódik. A találmány szerint kapható, permanensen tenyészthető sejtvonalak olyan sejttermékek előállítására is alkalmazhatók, amilyeneket a kiindulási sejtek nem termelnek, tehát heterológok, és amelyeknek genetikai információját csak a gén-ú jrakombináció módszerei szerint vittük be a már permanens hibridsejtbe, amelyek tehát heterológok. Heterológ sejttermékeknek a permanens hibridsejt által való előállítása például transzformációval érhető el. Kísérletek megmutatták, hogy a permanens sejtbe a találmány szerint egy vektor segítségével bevihető DNS, és így a bevitt kódolt termékek termelésére használható. A találmány szerinti permanensen tenyészthető sejtek ebből kifolyólag, amint említettük, vizsgálati objektumokként is használhatók hatóanyagok részére. A találmány további tárgya eljárás permanensen tenyészthető állati és humán sejtvonalakba idegen genetikai anyag bevitelére; amit az jellemez, hogy az idegen genetikai anyagot valamely vektorba, előnyösen E. coli eredetű vektorba, még előnyösebben pBR322 plazmidba építjük, a vektorral az említett sejtvonalak tenyészetét fertőzzük és a tenyészetből az idegen genetikai anyag által kifejezett fehérjét magéba foglaló transzfor- 5 máit sejtvonalakat kiválasztjuk. A következő példák a találmányt tovább szemléltetik. A leírás sorén a következő rövidítéseket és anyagelnevezéseket használjuk: AT antitest, 10 lg immunglobulin, H- illetve L-lánc az Ig-molekulák .nehéz" illetve .könnyű" lánca, Pristan 2,6,10,14-tetrametil-pen-15 tadekén, HAT-szelekciós táp talaj 20 TK HGPRT EBV MuuV 25 CB DMSO 30 DMEM FKS Ficoll 35 PEG PBS ’ POD ABTS BBSS RPM1 1640 45 TRIS PBL MNC 50 hTSH ß-hTSH FA 55 CFA IFA Methocel 1500 60 CMV hipoxantint, amino-pterint, fcimidint tartalmazó táptalaj, timidin-kinéz, hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz, Epstein-Barr-virus, Abelson egér-leukémia virus, citochalasin B antibiotikum (ALDRICH BIOCHEMICALS, Milwaukee, USA), dimetil-szulfoxid, Dulbecco-féle minimum esszenciális táptalaj, borjúmagzat-szérum, polimer nádcukor ([PHARMACIA), polietilénglikol, foszfét-pufferolt nátrium-klorid oldat, peroxidáz, 2,2 ’-azino- di( 3-etil- be nzotiazolin-6-szulfonsav )-ammóniumsó, Earle-féle egyensúlyi sóoldat, Rosewell Park Memory Institut (táptalaj jelzése), trisz(hidroxi-metil)-amino- me tán, perifériás vér-limfocita, mononukleáris sejtek (limfociták, monciták), humán pajzsmirígy-stimuláló hormon, a hTSH /5-lánca. Freund-féle adjuvéns, komplett Freund-féle adjuváns, inkomplett Freund-féle adjuváns, metil-cellulóz (FLUKA), citoplazma-membrán-hólyag, FITC-Covaspheres golyóformájú fluoreszcein-izotiocianát (COVALENT 65 TECHNICALS, AnnArbor, 7
