196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
30 196456 31 89 mmól/liter bórsav, 1 mraól/liter EDTA és 7 mól/liter karbamid) elektroforetizáljuk. A gélt a Fuji cég által gyártott röntgenfilmmel és erősítőernyővel -70 °C-on autoradiografáljuk. 5 9.2.3. Eredmények. A védett fragmensek nagysága nagyságjelzőkkel (32P-jelzett pBR 322 x Hinf 1 és pBR 322 x Hae III) való összehasonlítással ítélhető meg. Nem transzficiált 10 sejtek semmiféle globinspecifikus hibridizálási jelet .nem adnak (kivéve renaturált hibridizálási szondát = 210 Bp). A transzficiált immortalizált emberi epitelum-sejtekböl extrahált RNS két frag- 15 menst őrzött, amelyek nagyságát 80-90 Bp-vel határoztuk meg. Ilyen átiratokat Grosveld és mtsai. [Nature 295, 120-126 (1982) ] és Wéidlem U. mtsai. [Nature (1981)] is találtak, és a nyúl-ö-globin- 20 -génen lévő egy belső lappangó hasadási hely meglétéhez rendelték. Olyan átiratok, amelyek a nyúl-ű-globin-gén caphelyéről (ez a génnek az a helye, ahol az átirat az mRNS-re indul) szár- 25 máznák, nem voltak megállapíthatók. Egy összehasonlító kísérletben HeLa-sejteket pBR 322 RűG SV 40 plaziniddal transzficiáltak. Korrekt iniciált átiratokat (135 Bp, védett), valamint olyan átiratokat 30 állapítottak meg Si-térképezéssel, amelyeket egy belső lappangó hasadási hely jelenlétére vezettek vissza [Gros' veld, G, et. ab, Nature 295, 120-126 (1981) és Weidle, U. et ah, Nature 35 (1983) ]. 9.2.4. Értékelés Az a tény, hogy immortalizált emberi epitelium-sejtekben nyúl-/j-globin specifikus átíratok észlelhetők, amelyek egy 40 SV 40-böl származó eukarióta vektorral.- amely a nyúl-ű-globin-gént tartalmazza - vannak transzficiélva, azt mutatja, hogy ez a sejtvonal gazdarendszerként ismét bevezetett klónozott gének kifeje- 45 zésére alkalmas. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás pei’manensen tenyészthető állati vagy humán sejtvonalak előállítására normál állati vagy humán sejtek transzformáit sejtek komponenseivel végzett fúziójával, azzal jellemezve, hogy a normál állati vagy humán sejteket transzformált sejtek egyedül már nem szaporodóképes sejtfragmenseivel fuzionáljuk, és szelekciós anyagok nélküli tenyésztáptalajban tenyésztjük. (E: 1982. 05. 04.) 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziót polietilénglikol vagy Sendai-virus jelenlétében hajtjuk végre. (E: 1982. 05. 04.) 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtfragmensként transzformált sejtek citochalasin B-vel való kezelésével kapott karioplasztjaival vagy citoplasztjaival transzformálunk. (E: 1982. 05. 04.) 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtfragmensként transzformált sejtek lízisével vagy mechanikus feltárásával kapott sejtfragmensekkel, különösen magfrakciókkal vagy citoplazma-frakciókkal fúzionálunk. (E: 1982. 05. 04.) 5. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sejtfragmensként mitokondrium-dús citoplazma-frakcióval fuzionálunk. (E: 1982. 12. 09.) 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mielóma-sejtekből, Eppstein-Barr-vírussal fertőzött sejtekből vagy ascites-tumorsejtekböl származó, egyedül már nem szaporodóképes sejtfragmensekkel fúzionálunk. (E: 1982. 05. 04.) 7. Eljárás homológ vagy/és heterológ sejttermékek, így monoklonális antitestek, véralvadási faktorok és limfokinok előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 1-6. igénypont szerinti eljárással készített, pernienen sen tenyészthető állati vagy humán setjvonalat megfelelő tápközegben tenyésztünk és a keletkezett homológ és/vagy heteróg sejtterméket a tenyészetből elkülönítjük. (E: 1982. 12. 09.) 8. Eljárás az 1. igénypont szerinti permanensen tenyészthető állati és humán sejtvonalakba idegen genetikai anyag bevitelére, azzal jellemezve, hogy az idegen genetikai anyagot valamely vektorba, előnyösen E. coli eredetű vektorba, még előnyösebben pBR322 plazmidba építjük, a vektorral a tárgyi körben megnevezett sejtvonalak tenyészetét fertőzzük és a tenyészetből az idegen genetikai anyag által kifejezett fehérjét magában foglaló transzformált sejtvonalakat kiválasztjuk. (E: 1982. 05. 04.) Rajz nélkül A kiadósért felel a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója 89.1252.66-4 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Benkö István vezérigazgató 17
