196456. lajstromszámú szabadalom • Eljárás permanens állati és humán sejtvonalak előállítására
24 196456 25 pon. a) 1. fúzió (intakt Ag 8.653), b) 2. fúzió (Ag 8.653-fragmensek). 5. példa. HPBL (humán perifériális vér limfociták) fúziója a HS SULTAN humán plazmacitoma-vonalból származó fragmensekkel. Anyag. HS Sultant az American Type Culture Collection (ATCC)-böl kaptunk CRL-1484 kódszámú fagyasztva tartósított anyagként, és az ATCC-előírés szerint olvasztottuk fel és vettük tenyésztésbe. Kivitelezés. HPBL-t a 4. példában leírtak szerint, ugyanazon donortól nyertünk és dolgoztuk fel, és in vitro HBsi-vel .emlékeztettük’. Fúzió: 4 x 107 HS SULTAN-sejtet glicerin-lizissel fragmentálunk. A membrán-citoplazma-hólyag frakciót 5500 g-nél (40 perc) ülepítjük, és 4 x 107 HS-SULTAN-mag és 4 x 107 HPBL(B) keverékét rétegezzük rá. A PEG-fúzió a 4. példa szerint történik. A fúzionátumok tenyésztése 12 db 24-es Costar-féle csepptenyészetben RPMI 1G40 + 20% FKS + + piruvát + inzulin (Novo 2E/ml) + 1% nem-esszenciális aminosav (BM) + 1% Methocel 1500-ban HAT-adalék nélkül. Eredmények. Fúzió után 14 nappal: nagy, össze nem tapadó, limfoid sejttelepek növekedése. 6 6. példa. Emberi T-limfociták immortalizálása. 6.1. Anyag és módszerek. T-limfocitákat standard eljárással (rozettálás júh-eritrocitákkal, Ficoll-gradiens centrifugálás) izolálunk a teljes limfocita-frakcióból, és azonnal vagy 3 napos tenyésztés után dolgozzuk fel. Ehrlich-ascites-sejteket (ATCC; CCL 77) 10% lószérummal kiegészített DMEM-ben tenyésztünk, és ezek szolgálnak a transzformáló fragmensek forrásául. Az Ehrlich-ascites-sejtek fragmentálását Jett és mtsai. [J. Bioi. Chem. 252, 2134-2142 (1977)] szerint glicerin-lízissel végezzük. A túlnyomórészt maganyagot tartalmazó frakciót centrifugálással leválasztjuk, és eldobjuk. A mitokondriumokban dús citoplazma-membrán-hólyag (CMV) frakciót használjuk transzformáláshoz. 5 x 107 T-liinfocitát Phythamin-agglutinin (Difco) felesleggel terhelünk meg, az Ehrlich-ascites-sejtekböl származó CMV- frakcióval keverjük, és szobahőmérsékleten 20 percig inkubóljuk. Az elegyet centrifugálással ülepítjük, a folyékony feliilúszót maradéktalanul eltávolítjuk, és 1 ml 50%-os PEG-oldatot adunk az üledékhez. A PEG-oldatot 1 perces réhatási idő után RPMI-1640-táptalaj hozzáadásával hígítjuk, és a sejtektől centrifugálással elválasztjuk. A sejteket 20% borjú magzatszérumot (FKS, BM) tartalmazó RPMI-táptalajjal szuszpendáijuk, 12 db 1 ml-es csepptenyészetre osztjuk, és 37 °C-on 5%-os szén-dioxid atmoszférában tenyésztjük. A sejtek jellemzése a felületi jellemzők alapján standard eljárás szerint júh-eritrocitákkal való (E)-rozettálással [Kaplan, M. E. és mtsai.; J. Immunol. Methods 5, 131 (1974)) és immunfluoreszcencia segítségével a két T-sejt-specifikus antitest, OKT-3 (ortho) [Reinherz, E. L. et al.; J. Immunoi. 123, 1312 (1979)] illetve MÁK 4-11 [Rieber, P. et al.; Hybridoma 1, 59 (1981)] alkalmazásával és B-sejt-tipikus membrán-Ig kimutatására szolgáló fluoreszcens-jelzett anti-humán-immunglobulinnai (lg; Dako cég) történik. 6.2. Eredmények. Az első 14 napon belül a tenyészetekben a sejtek nagyrésze elpusztult. A 21. naptól kezdve voltak láthatók a sejttörmelékben kis és közepes nagyságú sejtek telepei, amelyekfolytonosan szapoi'odtak. Telepek növekedését mind a 12 csepptenyészetben észleltük, éspedig csepptenyészetenként egészen 50 telepig. A 30. napon a telepeket nagyobb tenyészedényekbe helyeztük ót, és tovább szaporítottuk. A sejteket felületi jellemzőik alapján analizáltuk, és a következő eredményeket kaptuk: a) E-rozetta-pozitiv: >95%, b) 0KT-3-pozitív: >90%, c) 4-11-pozitiv: >90%, d) Igs-pozitív: < 5%. 6.3. Értékelés. A fragmensek, amelyeket Ehrlich-ascites-sejtekből (permanens egérsejt-vonal) glicerin-lízissel nyerhetünk, izolált T-limfocitákkal való PÉG-fúzió után a tenyészetben permanens növekvő sejteket eredményeznek, amelyek felületi jellemzőik alapján egyértelműen T-limfocitákként azonosíthatók. 7. példa. Emberi endotelium-sejtek immortalizálása. 7.1. Anyag és módszerek. Az összes tenyészedénybe sejtekkel való beoltás előtt zselatint rétegezünk. A tenyész-táptalaj RPMI-1640 és 20% FKS-t tartalmazó 199 Boehringer-Mannheim táptalaj 1 : 1 arányú elegye. Emberi endotelium-sejteket Jaffe és mtsai. szerint [J. Clin. Invest. 52, 2745- -2756 (1973)] friss köldökzsinórok vénáiból nyerünk kollagenáz-oldattal (Gibco), és a transzformálás előtt primer tenyészet készítésével körülbelül 14 napon át szaporítjuk ezeket. A transzformáláshoz az összetapadva növő endotelium-sejteket tripszin-EDTA-oldattul (Boehringer-Mannheim) oldjuk, és a 6.1. pont alatt leírlak szerint az Ehrlich-as-5 10 15 20 25 30 36 40 45 50 55 C0 65 14
