196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
38 196455 39 két (amely 10 pg 32P-jelzett, SEA-val indukált mRNS-t és 200 ug SEA-val nem indukált mRNS tartalmaz) oldunk fel a PeLri-csészébe levő oldatban. A szűrőt impregnáljuk ezzel az oldattal és 40 “C hőmérsékleten 24 óra hosszat állni hagyjuk. Ezután a szűrőt szobahőmérsékleten 15 percen át kloroformmal mossuk. Ezt a mosást háromszor megismételjük. Ezután a szűrőt szobahőmérsékleten 15 percen át mossuk 4 x SSC oldattal (amely nátrium-kloridra 0,6 mól/liter és nátrium-citrátra (pH 7) 0,06 mól/liter koncentrációjú). Ezután a szűrőt 2 x SSC oldattal mossuk szobahőmérsékleten 15 percen át. A mosást 2 x SSC oldattal háromszor megismételjük. 2 ml 2 x SSC oldatot, amely 20 /ug/inl RN-áz A-t tartalmaz, öntünk egy Petri-esészébe. A fentebb nyert szűrőt ebbe a Petri csészébe helyezzük, és szobahőmérsékleten 30 percen át ebben tartjuk. Ezután a szűrőt kétszer átmossuk 2 x SSC oldattal, majd le\regőn megszárítjuk. A szűrőt autoradiográfiának vetjük alá. Ezek alapján az derült ki, hogy 500 000 telepből 7 volt hibridizálva a fenti mRNS-el. 10. lépés. Rekombináns plazmid képzése Egy, a 3. példa 9. lépése szerint nyert telepet oltunk 1 liter tripton tápközegbe, amely 2 literes Erlenmeyer lombikba van elhelyezve, majd 37 °C hőmérsékleten rázatjuk addig, amíg a keverék optikai sűrűsége 650 nm-nél mérve nem éri el a 0,8 értéket. Ekkor további 1 liter tripton-tápközeget adunk a lombikhoz. Ezután annyi klóramfenikolt adunk a lombikba, hogy a klóramfenikol-koncentráció 170 pg/ml legyen. Ezután a lombikot 37 °C hőmérsékleten 16 órán át rázatjuk. A tenyészetet 20 ml kloroform hozzáadásával, majd 10 percen át történő rázatással sterilezzük. A tenyészetet a kloroformtól elválasztjuk, majd 6000 fordulat/perc sebességgel, 4 °C hőmérsékleten 15 percig centrifugáljuk, így 2 g sejtet nyerünk. A sejteket 30 ml, 20 mmól/liter koncentrációjú Tris-HCl (pH 7,5) oldatban szuszpendáljuk. Ezután a szuszpenziót 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 4 °C hőmérsékleten 20 percen át, majd a sejteket ismét szuszpendáljuk 30 ml, 50 mmól/liter koncentrációjú Tris-HCl (pH 7,5) oldatban. A szuszpenzió térfogatéra számított 1/4 térfogat lizozim-oldatot (amely Tris-HCl-re (pH 7,5) mmól/liter, lizozimra 10 mg/milliliter koncentrációjú) adunk az Így nyert szuszpenzióhoz. Az igy nyert keveréket 0 °C hőmérsékleten 10 percig hütjük, majd a keverék térfogatára számított 1/3 térfogat mennyiségben 0,5 mól/liter koncentrációjú EDTA (pH 8,0) oldatot adunk óvatosan, rézás nélkül a keverékhez. Miután a keveréket 0 °C hőmérsékleten 10 percig állni hagytuk, 2 tömeg/térfogat%-os Triton X-100 (a Wako Junyaku Kogyo K. K. által gyártott felületaktív anyag) adunk a keverékhez, a keverék térfogatára számított 1/16 térfogat mennyiségben. 60 perc múlva a keveréket 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 0 °C hőmérsékleten 60 percen át. A felülúszót. átvisszük egy főzőpohárba. A főzőpohárba 3 mól/liter koncentrációjú nátrium-hídroxid oldatot öntünk keverés közben olyan mennyiségben, hogy a pH érték 12,5-re álljon be. További 3 perc keverés után 1/9 térfogat 5 mól/liter koncentrációjú nátrium-klorid oldatot és egy térfogat fenolt adunk az oldathoz és élénken keverjük 5 percig, majd 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 0 °C hőmérsékleten 10 percen át, igy a fázisok elválnak. A cirkuláris kettős szálú DNS-t tartalmazó felülúszót óvatosan elkülönítjük az egyszálú DNS-t tartalmazó tápközeg-fázistól. A felülúszót kloroformmal háromszor extraháljuk. 5 mg/ml koncentrációjú pankreatin RN-áz A-t adunk a cirkuláris kettős szálú DNS-t tartalmazó extraktumhoz olyan mennyiségben, hogy a pankreatin RN-áz A koncentráció 20 jug/Ml legyen. Az így nyert keveréket 37 °C hőmérsékleten 60 percen át inkubáljuk. 1/5 térfogat, 5 mól/liter koncentrációjú nátrium-klorid oldatot adunk a keverékhez. Ezután a keveréket kiegészítjük annyi 30 tömeg/térfogat%-os vizes polietilénglikol-oldat hozzáadásával (Polyethylene Glycol 6000, az Union Garbide Corporation, Egyesült Államok, gyártmánya), hogy végső koncentrációja 7,5 tömeg/térfogat% legyen. Miután az így nyert keveréket -10 °C hőmérsékleten 14 óra hosszat tartottuk, a keveréket 8000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk 0 °C hőmérsékleten 20 percig, így csapadék gyűlik össze. A csapadékot annyi, nátrium-kloridra 0,075 mól/liter és nétrium-citrátra 0,0075 mól/liter koncentrációjú oldatban oldjuk, hogy az oldat optikai sűrűsége 260 mm-nél mérve 20 legyen. Ezután 20 tömeg/térfogat%-os SDS oldatot adunk az igy nyert oldathoz olyan mennyiségben, hogy az SDS koncentráció 0,5 tömeg/térfogat% legyen. Az oldatot kiegészítjük annyi pronázzal, hogy a pronáz koncentrációja 0,5 mg/ml legyen, és 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az oldatot háromszor azonos térfogatú fenollal, majd kétszer azonos térfogatú kloroformmal extraháljuk. Az így nyert plazmidot szacharóz gradiens ülepítésnek vetjük alá 20 000 fordulat/perc sebességgel Beckmann SW-27 rotorban, 15 °C hőmérsékleten 15 órán át, így a frakcionálás végbemegy. A centrifugáláshoz Tris-HCl-re (pH 7,5) 50 mmól/liter és EDTA-ra 1 mmól/liter koncentrációjú oldatok és 5 és 23 tömeg/téfogat% közötti koncentrációjú szacharóz gradienst alkalmazunk. Az egyes így nyert frakciók optikai sűrűségét 260 nm-nél meghatározzuk. A DNS-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és a DNS-t nátrium-acetáttal és etanollal kicsapjuk a korábban leírt módon. A centrifugálás után 50 ug cirkuláris kettős szálú DNS-t nyerünk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
