196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
24 196455 25 Merigan módszerével mérjük [Humán interferonnal kiváltott tarfolt-gátlás mérése humán újszülött bőr fibroblaszt monoréteget és bovin vesicularis stomatitis vírust alkalmazva (A Plaque Inhibition Assay for Human Interferon Employing Human Neonate Skin Fibroblast Monolayers and Bovine Vesicular Stomatitis Virus): In vitro módszerek a sejt által közvetített immunitásban (In Vitro Methods in Cell-Mediated Immunity), E. D. B. R Bloom és P. R. Grade kiadása, Academic Press, New York, 1971, 489. o.] Az eljárást részletesebben ismertetve: minden egyes, 7. lépés szerint nyert pepiidet higitunk és 10 térfogat% borjú embrió szérumot tartalmazó növesztő tápközegbe helyezzük. A növesztő tápkőzegben FS-4 sejtek (human neonate skin fibroblast) monorétegét tenyésztjük. 18 óra múlva vesicularis stomatitis vírussal fertőzzük, amely 20 tarfoltot képes képezni sejtenként, és a tenyésztést 37 °C hőmérsékleten még egy óra hosszat folytatjuk. A sejteket ezután átöblitjük két rész fentemlitett összetételű növesztő tápközeggel. A sejteket ismét tenyésztjük a növesztő tápközegben 37 °C-on 24 órán át. A vírusok kifejlődését a sejtek mikroszkópos megfigyelésével ellenőrizzük. A sejten levő bármiféle károsodás a vírusoknak tulajdonítható. A következő peptidek mutattak lg/ml koncentrációban vírus-ellenes hatást: HC(O),- HC(-121, -126, -127, -133, -136, -150, -151), HC(-121, -126, -127, -133, -136), HC(-150, -151), HC(+121, +126, +127, +133, +136, +150, +151), HC(+121, +126, +127, +133, +136), HC(+150, +151), MC(O), MC(-121, -126, -127, -133, -136, -150, -151), MC(-121, -126, -127, -133, -136), MC(-150, -151), MC(+121, +126, +127, +133, +136, +150, +151), MC(+121, +126, +127, +133, +136) és MC(+150, +151). 10. lépés. A sejtnövekedést gátló hatás mérése 2.105 FS-4 sejtet juttatunk a 9. lépésben ismertetett nővesztő tápközegbe, amelyet 60 mm átmérőjű petri-csészébe helyezünk el. 5 órával később a növesztő táptalajt eltávolítjuk. Ezután friss, 0,1 Mg/ml koncentrációban HC(0) pepiidet vagy a fenti 7. lépés szerinti MC(O) peptidet tartalmazó növesztő tápközeget öntünk a petri-csészébe, és a tenyésztést 37 °C hőmérsékleten folytatjuk 18 órán át. A tápközeget eltávolítjuk és 5 Ci/ml koncentrációban 3H-timidint tartalmazó friss növesztő táptalajt adunk a tenyészethez, majd 37 °C hőmérsékleten 2 órán ét tenyésztjük. A sejteket foszfát-pufferes sóoldattal leöblítjük és 5 súl,v%-os vizes triklórecetsav-oldatot adunk hozza. Az Így keletkezett maradékot szárítjuk és 3H radioaktivitás mérésnek vetjük alá folyadék-scintillációs számlálóval (Packard Instrument Company, Inc., Egyesült Államok gyártmánya). Összehasonlítás céljából előállítjuk a David V. Goeddel által kikövetkeztetett pro-IFN-^, IFN-ü és IFN-y-szerü peptid aminosav-szekvenciájának megfelelő peptideket az itt leirt szilárd fázisú szintetikus módszerrel, és az itt ismertetett sejt-növekedés gátló hatás-mérésnek vetjük alá azokat. Anyag Mennyiség Timidin-beépülés Nincs anyag Mg/ml cpm % (kontroll) — 2500 100 HC(O) 0.1 200 8 MC(O) 0.1 200 8 pro-IFN-^ 0.1 2500 100 IFN-jj IFN-^-szerű 0.1 2000 80 peptid 0.1 2000 80 Látható, hogy a jelen találmány szerinti HC(O) és MC(O) peptidek nagyon hatásosak a sejt növekedésének gátlásában, míg a pro-IFN-y nem képes gátolni a sejt növekedését, és az IFN-'i és IFN-^-szerű pepiidnek is csak igen csekély a hatása a sejtnövekedésre. 2. Példa 1. lépés. Benzoilezés vagy izobutilezés A. A dbzA szintézise 5 mmól dezociadenozint (dA) szuszpendálunk 150 ml száraz piridinben. 300 mmól benzoil-kloridot teszünk hozzá cseppenként jéggel történő hűtés közben, majd a keveréket szobahőmérsékletre melegítjük, és kb. 1 óra hosszat keverjük. A reakció teljességéről vékonyrétegkromatográfiás (TLC) vizsgálattal győződünk meg (futtató: kloroform-metanol (10 : 1). A reakciókeveréket ezután 500 ml kloroform, 350 g jég és 28 g nátrium-hidrogén-karbonát keverékébe öntjük. Az így kapott keveréket választótölcsérbe kirázzuk, és a kloroformos fázist félretesszük. A vizes fázist két rész kloroformmal extraháljuk. Az így nyert kloroformos fázisokat egyesítjük és két rész vízzel mossuk. A kloroformot ledesztilláljuk, 150 ml etanolt és 100 ml piridint adunk a maradékhoz, és Így homogén oldatot nyerünk. Ezt a homogén oldatot gyorsan 0 °C hőmérsékletre hűtjük, 200 ml 2 n vizes nátrium-hidroxid oldatot és 200 ml etanolt adunk hozzá az oldat keverése közben, Így homogén oldat keletkezik. Az így kapott oldatot szobahőmérsékleten 5 percig keverjük, hütjük, és 200 ml 2 n vizes sósav-oldat hozzáadása után fele térfogatra kon-6 10 15 20 25 30 35 4C 45 50 55 60 65 14
