196455. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyhatású peptideket adó transzformánsok előállítására
20 196455 21 Boc - HC* (+121, +126, +127, +133, +136) - gyanta, Boc - HC* (+150, +151) - gyanta, Boc - MC* (0) - gyanta, Boc - MC* (-121, -126, -127, -133, -136, -150, -151) - gyanta, Boc - MCT (-121, -126, -127, -133, -136) - gyanta, Boc - MC* (-150, -151) - gyanta, Boc - MC* (+121, +126, +127, +133, +136, +150, + 151) - gyanta, Boc - MC* (+121, +126, +127, +133, +136) - gyanta és Boc - MC* (+150, +151) - gyanta, - ahol MC* jelentése metionil HC , HC (0) jelentése Cys(Bzl) Ile Val Leu Gly Ser(Bzl) Leu Gly Cys(Bzl) Tyr(Bzl) Cys(Bzl) Gin Asp(OBzl) Pro Tyr(Bzl) Val Lys(Z) Glu(OBzl) Ala Glu(OBzl) Asn Leu Lys(Z) Lys(Z) Tyr(Bzl) Phe Asn Alá Gly His(Bzl) Ser(Bzl) Asp(OBzl) Val Ala Asp(OBzl) Asn Gly Thr(Bzl) Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys(Z) Asn Trp Lys(Z) Glu(OBzl) Glu(OBzl) Ser(Bzl) Asp(OBzl) Arg(NŰ2) Lys(Z) lie Met Gin Ser(Bzl) Gin Ile Val Ser(Bzl) Phe Tyr(Bzl) Phe Lys(Z) Leu Phe Lys(Z) Asn Phe Lys(Z) Asp(OBzl) Asp(OBzl) Gin Ser(Bzl) Ile Gin Lys(Z) Ser(Bzl) Val Glu(OBzl) Thr(Bzl) Ile Lys(Z) Glu(OBzl) Asp(OBzl) Met Asn Val Lys(Z) Phe Phe Asn Ser(Bzl) Asn Lys(Z) Lys(Z) Lys(Z) Arg(N02) Asp(OBzl) Asp(OBzl) Phe Glu(OBzl) Lys(Z) Leu Thr(Bzl) Asn Tyr(Bzl) Ser(Bzl) Val Thr(Bzl) Asp(OBzl) Leu Asn Val Gin Arg(NÜ2) Lys(Z) Ala Ile His(Bzl) Glu(OBzl) Leu Ile Gin Val Met Ala Glu(OBzl) Leu Ser(Bzl) Pro Ala Alá Lys(Z) Thr(Bzl) Gly Lys(Z) Arg(N02) Lys(Z) Arg(N02> Ser(Bzl) Gin Met Leu Phe Arg(NÜ2) Gly Arg(N02) Arg(N02) Alá Ser(Bzl) Gin - ahol a szimbólumok jelentése azonos a korábban meghatározott jelentésekkel, a zárójelen belül alkalmazott, (-) jelzéssel ellátott szám azt jelzi, hogy egy aminosav a HC*(0) karboxil-csoportjától számított aminosav-számnál az adott Boc-peptidból hiányzik, és a zárójelen belül alkalmazott ( + ) jelzéssel ellátott szám azt jelzi, hogy az aminosav aminocsoportjára a HC*(0) karboxil-csoportjától számított aminosav-számnál egy glicin kapcsolódik. 7. lépés. HC és MC lehasitása a gyantáról; a HC és MC abban különböznek a HC*-tól és MC-től, hogy nincsenek védócsoportjaik, mig a HC^-nak és MC*-nak vannak. Politetrafluoretilénnel burkolt keverövel ellátott reakcióedénybe 1,4 g 6. lépés szerint nyert Boc-HC* (O)-gyantát és 1 ml anizolt táplálunk be. 20 ml hidrogén-fluoridot táplálunk be a reakcióedénybe és szárazjég/aceton eleggyel hűtés közben 0 °C-on egy órán át keverjük, majd a keveréket 0 °C hőmérsékleten, csökkentett nyomáson bepároljuk a hidrogén-fluorid eltávolítása érdekében. Az így nyert HC(0) peptidet úgy nyerjük ki, hogy 1 súly%-os ecetsav-oldatot adunk keverés közben a maradékhoz, miáltal a peptidet extraháljuk, majd választótölcsérben dietiléterrel mossuk, végül liofilizáljuk. A fenti művelet alapján 150 mg-os mennyiségekben a következő peptideket nyerjük a 6. lépés szerint nyert Boc-peptidil-gyantákból: HC-121, -126, -127, - 133, -136, -150, -151), HC(-121, -126, -127, -133, -136), HC(-150, -151), HCÍ + 121, +126, +127, +133, +136, +150, +151) HC(+121, +126, +127, +133, +136), HC(+150, +151), MC(O) MC(-121, -126, -127, -133, -136, -150, -151), MCÍ-121, -126, -127, -133, -136), MC(-150, -151), MC( + 121, +126, +127, +133, +136, +150, +151), MC( + 121, +126, +127, +133, +136) és MC(+150, +151). 8. lépés. A szintetizált peptidek analitikai adatai A 7. lépésben nyert peptidek mindegyikéből molekulatömeg-maghatározást, aminosav-összetétel vizsgálatot és aminosav-szekvenciavizsgálatot végzünk. Az egyes peptidek molekulatömegét az SDS gél-elektroforézissel mért mozgékonyságuk alapján határozzuk meg. A mólszázalékban mért aminosav-összetételt a következő módon határozzuk meg: az egyes peptidekből egy alikvotot hidrolizálunk 6 n vizes sósavoldatban 110 °C hőmérsékleten 24 órán át és a kapott keveréket síkban fekvő papirkromatográfiával vizsgáljuk. Ezzel a vizsgálattal a triptofán, cisztin és cisztein nem határozható meg. Egy másik alikvotot proteolitikus módon enzimmel emésztünk a triptofán, cisztin és cisztein koncentrációjának meghatározása érdekében. A glutaminsav nem különböztethető meg a glutamintól és az aszparaginsav nem különböztethető meg az aszparagintól. Az egyes peptidek aminosav-szekvenciáját automatikus aminosav-analizétorral határozzuk meg (Hitachi, Ltd., Japán). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
