196454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sokmásolatú élesztő vektorok előállítására
10 196454 11 plazmidot YCRp2-nek neveztük. E plazmid restrikciós térképét az 1. ébrén mutatjuk be. Az élesztőben lévő plazmid másolatszómának és stabilitásénak a meghatározáséhoz YCRp2 plazmid DNS-sel transzformáljuk a SHU 32 élesztő törzset (trpl-, leu2~, ura3"). A transzformált TRP sejteket izoláljuk, s ezeket stabilitás és másolatszám szempontjából vizsgáljuk. Az eredményeket az 1 táblázat tartalmazza. Az YCRp2 plazmid stabilitását úgy vizsgáljuk, hogy a transzformált sejteket különböző szénforrésokkal tenyésztjük. Ha a transzformált YCRp2 sejteket csak glükózos táptalajban tenyésztjük, akkor a plazmid stabilitása olyan tartományban van, mint a többi YCp plazmidé (körülbelül 80%); a másolatszám csekély (1-2 másolat sejtenként; lásd az 1. táblázat 1-es és 3-as példáját, valamint a 3. ábra 1. és 2. oszlopát). Ez várható is volt, mivel a glükóz dezaktiválja az ADH2 promotert (ADH2-AUS) és hagyja, hogy a CEM3 szekvencia normálisan működjék (CEN3- -AN). 5 Amikor azonban a transzformált YCRp sejteket etanol tartalmú táptalajban tenyésztjük, extrém módon lezuhan a plazmid stabilitása (körülbelül 36%-ra); a másolatszém azonban sejtenként 1-10 másolatra emelkedik. 10 Az YCp plazmidok ugyanilyen feltételek mellett, mint előzőleg is, igen stabilak és csekély a másolatszámuk (lásd az 1. táblázat 2. és 4. példáját). Ez mutatja, hogy az újból reaktivált ADH2 promoter transzkripciója 15 (ADH2-AN) blokkolja a CEN3 szekvenciát (CEN3-AUS); az eredmény az, hogy az YCRp2 plazmid úgy viselkedik, mint egy YRp plazmid, amelyet nagymértékű instabilitás, de magas másolatszám jellemez! 20 1. táblázat Példa Törzs Plazmid Szénforrós a .táptalajban A plazmid stabilitás %-bana> Másolatszámb) 1. SHU 32 pBC3Tl glükóz 80 1-2 2. SHU 32 PBC3T1 etanol 76 1-2 3. SHU 32 YCRp2 glükóz - 3-78 1-2 4. SHU 32 YCRp2 etanol 36 5-10 5. SHU 32 YCRp2 etanol- glükózc> 95 5-10 6. SHU 32 YCRp2 etanol-glükózd> 95 8-12 a) A plazmid stabilitását, mint ahogy leírtuk, százalékban fejezzük ki, amelyet a nem szelektív körülmények közti tenyésztés esetén 25 generáció után határozunk meg. b) A másolatszém meghatározása a szelektív táptalajon való tenyésztésnél 12 generáció utón történt. c) A törzset 12 generáción keresztül etanol tartalmú szelektív táptalajon tenyésztettük, majd glükóz tartalmú szelektív táptalajra vittük át, ahol 12 generáción keresztül tenyésztettük és ebből a tenyészetből kivett inokulumból határoztuk meg a stabilitást és a másolatszámot. d) A törzset úgy tenyésztettük, hogy a c)keresztül tenyésztettünk. Meglepő módon az YCRp plazmid stabilitása szinte magasabb lesz, mint volt, ha a táptalajt újra glükózra állítjuk ót. Ebben a táptalajban a stabilitás körülbelül 95%-os és a másolatszám konstans marad, sejtenként 5- 10 másolattal (lásd az 1. táblázat 5. példáját és a 3. ábra 3. oszlopát). A glükóz dezaktiválja megint az ADH2 promotert (ADH2-AUS) és reaktivólja a CEN3 funkciót (CEN3-AN). Maga az élesztő azonban nem tudott az etanolon való tenyésztés folyamán az YCRp plazmidból több másolatot akkumulálni. Még az YNB+CAA-etanol táptalajon 50 generáción át történő tenyésztés utón sem haladja meg a másolatszám a sejtenkénti 8-12 másolatot (lásd az 1. táblázat 6. példáját és a 3. ábrán a 4. oszlopot). nél leírtuk, de etanolos táptalajban 50' generáción Az YCRp3 és az YCRp4 plazmid előállítása Az YCRp3 és YCRp4 plazmid előállítását 50 a 2. ábrán sematikusan ábrázoljuk. A pJDB- 207 klónozó vektorra vonatkozó adatokat már korábban közölték [J. Beggs, Nature, 275, 104-109 (1978)]. A pJDB207 a bakteriális pAT153 plazmidot [A. Twigg és D. Sherratt, 55 Nature, 283, 216-218 (1980)] tartalmazza, ampicillin - (ApR) és tetraciklin- (TetR) génnel és a ColEl replikációs kezdőpontjával (ŐRI) a szelektálás és az E. coliban való stabil növekedés érdekében. A plazmid ezenkívül a 2 m 60 plazmid DNS-ének egy 2,7 kb hosszú Eco- RI/EcoRI fragmentumát is tartalmazza. Ezen a 7
