196453. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak azonosítására
6 196453 7 rülbelül 10 000 bázist tartalmaz a Chlamydia trachomatisra jellemző DNS-ből a pBR322 vektorhoz kötve. A plazmid DNS modellként szolgál, a baktérium genom DNS-ját képviseli. Alkalmazás előtt a plazmidot 0,02 mól/l-es nátrium-hidroxidban 5 percig forraljuk, majd az oldatot ecetsavval semlegesítjük. A sztreptavidint, amit az affinitáspár egyik tagjaként használunk, CNBr-dal aktivált Sepharosehoz (Pharmacia gyártmány) kötjük Axen és mtsai [Nature 214 1302-1304 (1967)] módszere szerint. A vizsgálathoz a vizsgálócsőbe 500 000 cpm detektor-mintát, 50 ng megkötő-mintát és 10 ng cél DNS-t mérünk. A minta térfogatát 20 pl-re egészítjük ki az 1. példában megadott pufferreL Kontroll DNS-ként borjú timusz DNS-t alkalmazunk. Az elegyet 65 °C-on 60 percig inkubáljuk, majd 500 pl 0,1 mól/1 pH 7,5-ös trisz-HC1, 0,1 mól/1 NaCl, 2 mmól/MgCh és 0,05% triton X-100 tartalmú pufferoldatot adunk hozzá. Végül az oldatot 0,2 ml sztreptavidin-Sepharose töltetű oszlopon frakcionáljuk. Az oszlopot 10 ml fenti pufferrel és 10 ml 0,015 mól/1 nátrium-klorid, 0,015 mól/1 pH = = 7,6-os nátrium-foszfát és 0,5% nátrium-dodecil-szulfát tartalmú 50 °C-os pufferrel mossuk. így a biotinilezett DNS a sztreptavidinhez kapcsolódik, mig a többi DNS áthalad az oszlopon. A radioaktivitás a hibridképzödés folytán jelenik meg a mintában. A hibrid radioaktív anyag tartalmát úgy mérjük, hogy a teljes oszlopot gammaszámláló számlálócsövébe helyezzük. Eredményeink a kővetkezők: i25J aktivitás (cpm) Cél-nukleinsav 10 ng kontroll . DNS 10 ng pKTH 1220 1350 115 3. Példa pBR 322 plazmid DNS azonosítása antigén-antitest pér segítségével Detektor-próbaként a pBR322 plazmid (kereskedelmi forgalomban beszerezhető) olyan származékát alkalmazzuk, amelyből a Pstl-Sall (3613-651) fragmentumot előzetesen eltávolítottuk. A plazmidot ismert módon [Forster és mtsai, Nucleic Acids Res. 13, 745- -761 (1985)] és kereskedelmi forgalomból beszerzett reagensekkel (Bresa, Adelaide, Ausztrália) fotobiotinnal jelezzük. Megkötő-mintaként pBR322-Pstl-SalI fragmentumot tartalmazó M13mpll rekombináns fág DNS-ját használjuk. A DNS ismert módon szulfonált (Orgenics Ltd. Yavne, Israel). A pBR322 plazmidot hordozó E. coli HB101 minta mennyiségét kloramfenikolos sokszorozás alkalmazásával növeljük (Maniatis és atsai, Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982). A baktérium sejteket lizozimmal lizáljuk, majd nótrium-hidroxiddal forraljuk Palva közleményében [J. Clin. Mikrobiol. 18, 92-100 (1983)] ismertetett módon. Antiszulfon monoklonális antitesteket alkalmazunk polisztirol mikrotiter lyukak ismert módon való bevonására. (Hybridomas: a new dimension in biologycal analyses, Me Kearn; kiadó: Kennett és mtsai, Plenum Press, 1980). A vizsgálathoz 5x10s lizált E. coli sejtet (pBR322-vel, illetve anélkül) 100 ng megkőtő-minta DNS-val és 100 ng detektor-mintával 50 ul hibridizációs elegybe viszünk. A körülmények az 1. példában megadottak, azzal az eltéréssel, hogy az elegyhez 5% poli(etilén-ghkol)-t (PEG 6000) adunk és a nátrium-dodecil-szulfótot 0,1% koncentrációban alkalmazzuk. A hibridizálást követően az oldatot 0,02 mól/l-es, pH = 7,6-os nátrium-foszfáttal 250 /ul-re hígítjuk, majd az oldatot az antitesttel bevont mikrotiter lyukakba visszük. Ezt ezután 2 órán ét 37 °C-on inkubáljuk. A lyukakat ezután 0,15 mól/1 nátrium-kloridot, 0,02 mól/1 pH = 7,6-os nátrium-foszfátot és 0,0'i% triton X-100-t tartalmazó oldattal mossuk. A detektor-mintát a következő módon tesszük láthatóvá: sztreptavidint (Bethesda Research Laboratories) adunk hozzá, mossuk, biotinilezett lúgos foszfatézt (Bethesda Research Laboratories) adunk hozzá, majd Leary és mtsai által leírt módon mossuk [Proc. Natl. Acnd. Sei. USA, 80, 4045-4049 (1983)]. Végül 25C pl 35 mg/ml-es pH = 10-es dietanol-amin-pufferes p-nitro-fenil-foszfát oldatot (Szigma! adunk hozzá. 60 perc reakcióidő eltelte útin 410 nm-en mérjük az abszorpciót. • Eredményeink a következők: A-410 nm Cél-nukleinsav, pBR 322 men-pBR 322 tartalmú sejtek tes sejtek >2 0.15 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás nukleinsavak oldatban való azonosításéra hibridizációs módszerrel azzal jellemezve, hogy legalább két azonos oldott fázisban lévő mintát alkalmazunk, egy detektor-mintát kimutatható jelzőanyaggal jelzünk és egy megkötő-mintához kötjük, amely utóbbi egy affinitáspár egyik tagja, és a hibridizációs reakcióban kapott megkötő-minta, cél-n ikleinsav, detektor-minta hibridet az affinitáspór másik tagja segítségével izoláljuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy affinitáspárként biotin, sztreptavidin vagy biotin, avidin pórt alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
