196452. lajstromszámú szabadalom • Eljárás mikrobiológiai úton előállított alfa- és béta-interferonok, ezeket kódoló DNS-szekvenciák, genetikai információt tartalmazó mikroorganizmusok előállítására
10 196452 11 Az az interferon szekvenciákat tartalmazó transz-formáit E. coli kiónok szelekciójára alkalmas módszer, mely ennek a találmánynak alapjául szolgál, egy 5’dCCTTCTGGAACTG3’ szekvenciájú szintetikus tridekanukleotid használatán alapszik. Ez a szekvencia képviseli azt a leghosszabb és egybefüggő DNS szegmentumot, amely homológiát mutat az IFN-oC-t kódoló gének legtöbbjében és az IFN-ß-t kódoló génben. A tridekanukleotid szintézise ismert. A tridekanukleotidot a molekula 5* végén jelezzük 37 °C-on, 30 percen ét a következő elegyben: 50 mM trisz-sósav (pH = = 7,5), 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin, 1 mM “P-í-ATP és 60 egység/ml T4-polinukleotid kinéz (Bethesda Research Laboratories). A jelzett tridekanukleotid specifikus aktivitása körülbelül 500 Ci/mMól. Az ily módon jelzett tridekanukleotidot primerként használjuk a (egyszálú) cDNS szintéziséhez, ahol a Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből származó poli(A)*RNS (lásd a B példát) szolgál templátként. A reakciót a primernek az RNS-hez viszonyított 50-10- -szeres feleslegében folytatjuk le 90 percen ót 37 °C-on a kővetkező elegyben: 50 mM trisz-sósav (pH = 8,3), 60 mM kálium-klorid, 5 mM DTT, 50 /ug/ml Actinomycin D, 4 mM magnézium-klorid, 4 mM nátrium-pirofoszfát, 0,5-0,5 mM dNTP és 100 egység/ml AMV reverz transzkriptáz. Az RNS-DNS-hibrid RNS részét 50 °C-on 0,3 M nátrium-hidroxidban történő egy órás inkubálással távolitjuk el, ezután az elegyet 0,3 M ecetsavval semlegesítjük és ekkor az Így előállított cDNS-t hibridizációs próba-anyagként használhatjuk. Az eljárás sematikus ábrázolását a ' 2. ábra mutatja be. Az Így előállított cDNS-ból csak azok a molekulák hordozzák a radioaktív jelzést, amelyek az interferon specifikus tridekanukleotidból, mint primerból kiindulva szintetizálódtak, s így nagy specificitást mutatnak interferon-DNS-szekvenciák felismerésére hibridizálás esetén. E példa Telephibridizélás tridekanukleotid printerrel előállított cDNS-el Az ebben a példában leirt módszer azoknak a transzformált baktériumklónoknak a felismerésére szolgál, amelyek tridekanuk-leotid komplementer DNS szekvenciákat hordozó hibrid plazmidokat tartalmaznak. Az egyes klónozott transzformált sejtekből sejteket viszünk rá nitorcellulóz szűrólemezre (pórusnagyság 0,45 pm, Millipore vagy Schleicher-Schuell gyártmány), a szűrőmembránon addig tenyésztjük, mig a telep nagysága el nem éri a 2 mm-t, majd a telepeket kolónia hibridizációhoz készítjük elő az irodalomból ismert módszerrel [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961-3965 (1975) és Analytical Biochemistry, 98, 60-63 (1979)]. A jelzett cDNS-el történő nukleinsav hibridizálást 48 órán át végezzük, 37 °C-on, a következő elegyben: 50% formamid, 4 x SET [1 x SET = 0,15 M nátrium-klorid, 5 mM EDTA, 50 mM trisz-sósav (pH = 8)J, 1 x Denhardt oldat (0,02% BSA, 0,02% Ficoll, 0,02% polivinilpirrolidon), 0,5 mg/ml denaturált és zúzott (gescherter) lazac sperma DNS, 0,1% nátrium-pirofoszfát és 0,1% SDS. Ezután a szűrőmembrénokat több órán keresztül (6-8 óra) mossuk 20- -25 °C-on a következő összetételű oldatban: 50% formamid és 0,2 x SSC (1 SSC = 0,15 M nátrium-klorid, 0,15 M nátrium-citrát), majd 1 x SSC oldattal leöblítjük. A szűrómembránokat 20-25 °C-on megszáritjuk és -70 °C-on röntgenfilmre (Kodak XR) exponáljuk. A 3» ábra egy ilyen kísérletre jellemző képet mutat be: az ábrázolt felületen 1536 baktérium kolóniát tenyésztettünk és kolónia hibridizációval vizsgáltuk. A nyíl egy olyan transzformáit baktérium kiónra mutat példákként, amelyben a hibrid plazmid-DNS a radioaktív próba-anyaggal jelet adott. Összesen körülbelül 13.000 transzformált baktérium telepet vizsgáltunk, amelyekből 190 olyan kiónt izoláltunk, amelyek a Sendai vírussal indukált Namalwa sejtekből származó tridekanukleotiddal iniciált cDNS-el pozitív jelet adtak; ezeket két mikrotitráló lemezre (Pl és P2) gyűjtöttük össze. Fentiek szerint a klónbank kiónjainak körülbelül 1%-a tartalmazta a specifikus dCCTTCTGGAACTG szekvenciát. F példa A tridekanukleotid printerrel előállított cDNS-el hibridizált kiónok szekvencia komplexitásának vizsgálata Ahhoz, hogy a 190 tridekanukleotid-pozitiv kiónban (lásd az E példát) a különböző szekvenciájú kiónok számát (szekvencia komplexitás) megállapítsuk, a különböző klónokból Pst I-el történő emésztéssel (lásd a C példát), 0,8%-os agaróz gélben végzett elektroforézissel, majd a kivént sáv elúciójával (a sávot tartalmazó géldarabkát kivágjuk és az agarózból a DNS-t elektroforetikusan eluáljuk egy dializáló hurkában) izoláljuk a cDNS inszertumokat, majd ezeket az irodalomból ismert módszerrel, nick-traszláció segítségével 32P-vel jelezzük [J. Mól. Bioi. 113, 237-251 (1977)]. A Pl és P2 mikrotitráló lemezen lévő tridekanukleotid pozitív kiónoknak és egy önkényesen kiválasztott mikrotitráló lemezen (E52) lévő kiónoknak a lenyomatait nitrocellulóz szürömembránra vittük át, itt tenyésztettük, a tenyészetet telep hibridizáláshoz előkészítettük (lásd az E példát) és a különböző 32P-vel jelzett cDNS inszer-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
