196312. lajstromszámú szabadalom • Eljárás aktivált polimer-anyagú hordozó előállítására
1 196 312 2 A találmány kémiailag módosított es aktivált hidroxilcsoportokat tartalmazó természetes és mesterséges polimer-anyagú hordozófelületek előállítási eljárására vonatkozik. A találmány szerinti hordozók alkalmasak biológiai-, biotechnológiai cs orvosi területen analitikai és preparatív eljárásoknál különböző fehérjék, nukleinsavak, kis molekulatömegíí lignndumok, sejtek, mikroorganizmusok, valamint más biológiai anyagok megkötésére. A hordozóhoz kötött biológiailag aktív anyagokat régóta alkalmazzák specifikus kölcsönhatásű anyagok szétválasztására és elválasztására (lásd: H. D. Orth, W. Brümer: Angew. Chem. 84 /1972/ 319; W. B. Jakob, M. Wilchek: Methods in Euzymol. 34/1974/), enzimek megkötésére enzimreaktorként (lásd: K. Mosbach: Methods in Enzymol. 44 /1976/), valamint biológiailag hasznos vegyületek kvantitatív és kvalitatív kimutatására a biológiai, biotechnológiai és orvosi kutatásban. Az ideális mátrixanyaggal szemben általában a következő követelményeket támasztják: oldhatatlanság, makroporozitás, mechanikai és kémiai stabilitás, alkalmas forma, hidrofllitás, csekély nem-specifikus kötés, mikrobás és enzimatikus hatásokkal szembeni ellenállóképesség, kémiai aktiválásra és módosításra alkalmas csoportok jelenléte. Olyan málrixanyag azonban, amely a felsorolt követelmények mindegyikét kielégíti, nemigen van. Éppen ezért az utóbbi években számos hordozóanyagot írtak le és hoztak forgalomba, amelyek anyaga igen változatos és például a következőket foglalja magában: természetes polimerek (poliszaccharidok, így péidául dextrán vagy agaróz, szintetikus polimerek, így például pofi(vinil)-alkoholok), akrilsavszármazékok, vinil-polimcrek, valamint természetes és mesterséges anyagok kopoiimerjei, így például agaróz és poliakrilamid kopoiimerjei. Ezek az anyagok több-kevesebb hidroxilcsoportot tartalmaznak a felületükön, amelyek lényegében a hidrofil tulajdonságot és így a csekély nem-specifikus kötést biztosítják. A biológiailag aktív anyagok, így például fehérjék, lektinek, enzimek, nukleinsavak, kis molekulatömegíí ligandumok, sejtek és más biológiai anyagok megkötésének feltétele, hogy a felületen kémiai kötést biztosító kémiailag aktív csoportok legyenek. Ez, az aktiválásnak nevezeti kémiai módosítás elvileg a mátrix és a ligandum funkcionális csoportjainak típusától függ, mértékét azonban a mátrix kémiai stabilitása, valamint a ligandum biológiai tulajdonsága határozza meg. Az aktiválási eljárás megválasztását a következők határozzák meg: technológiai ráfordítások és az. ezekkel összefüggő költségek, a bevitt kémiai csoportok reakcióképessége, az aktivált hordozók tárolási lehetőségei, a módosításhoz alkalmazott reagensek toxieitása és biokompatibilitása, valamint a hordozó és ligandum közötti kötés stabilitása. A számos korlátozó és figyelembe veendő paraméternek köszönhetően érthető, hogy a sok hordozóanyaggal kapcsolatban csupán kevés aktiválási eljárást ismertetnek. Az ismert aktiválási eljárások közül meg említjük például a következőket: aktiválás glutáraldehiddel vagy más homo- vagy heterobifunkcionális reagensekkel, hidraz,innal, biszcpoxiránnal, divinilszulfonnal, benzokinonnal, karbonil-imidazoiokkal, friazin-származékokkal, toz.il-kloriddal végzett aktiválás, továbbá a CNBr-aktiválási eljárás, valamint a perjodát-oxidáció és a diazotálás (lásd J. M. Égly, E. Boschetti: Practical guide for use in affinity chromatography and related techniques, 1BF-LKB, 1983). A legelterjedtebb módszer az Axcn és munkatársai iltal leírt, bróm-ciánnal végzett eljárás (lásd: K. Axcn, 1. Porath, S. Ernback: Nature 214 /1967/ 1302). Bár ezt az eljárást kétségtelenül a leggyakrabban alkalnazzák a biológiai és biotechnológiai kutatások területén, hátránya, hogy relative instabil kötést biztosít a hordozó és a ligandum közölt (különösen pH 5 és 10 xözötti értéken) és ez a megkötött ligandumok nem jelentéktelen mértékű felszabadulásával jár. Ez a tény rz eljárás alkalmazását az orvosi in vivo kísérleteknél gén korlátozza, továbbá a bróm-cián toxieitása és elületen a kationos csoportok kialakulásának ■cszélye szintén az eljárás ellen szól. A hidrazinunl való aktiválás hátránya, hogy kivitelezésnél technikai nehézségek léphetnek lel és a nagy nolekulatömcgű ligandumok esetében a kötések méréke alacsony. Más aktiválási eljárásoknál hátrány a reagensek nagyfokú toxikussága (divinil-sz.ulfon, triazin-szárma:ékok, epiklórhidrin) és/vagy az eljárás költséges volta divinil-szulfon, íozil-klorid, trezil-klorid), a kötési "olyamat alatti kedvezőtlen körülmények, amelyek a biológiai anyagok inaktiválásához vezethetnek (bizepoxirán, triazin-származékok,epiklórhidrin), magasabb pH-értékekné! instabil kötések (divinil-szulfon, xarbonil-áiimidazol, diazónium-vegyületek), hosszú aktiválási és kötési idők (epiklórhidrin, biszepoxirán), echnolőgiai problémák, amelyek az eljárás költségeit növelik (triazin-származékok, tozilklorid, karbonil-diimidazol, diazotálás), alacsony kötési kihozatal (per jodát-ox'dáció, valamint a relatíve erős „charge transfer” kölcsönhatásokra visszavezethető nem-specifikus cötések kialakulása (benzokinon, triazin-származékok, diazonium-vegyüietck). Ismert az is, hogy Si02-felületeken, elsősorban üvegen, az OH-csoportok különböző kémiai szereket, különösen különböző funkciós csoportokat tartalmazó organoszilánokat megkötni képesek (lásd: R. A. Messing. II. I). Weelall: US-Pnlent 3519538; íl. II. Weclall, N. Y. Elmira: US-l’alent: 3652761; II. II. Weetall: Methods in Enzymol. 44 j1976/ 134). A 117.607 számú európai szabadalmi bejelentésben sziloxánokkal kezelt poii(vinil-alkoholok) előállítását ismertetik, amelyet ragasztószalagoknál alkalmaznak. A találmány célja egyszerű, olcsó, nem toxikus aktiválási eljárás biztosítása természetes és mesterséges polimer-anyagú hordozók felületén levő OH-csoportok aktiválására, amely hordozók így alkalmas feliérjék, nukleinsavak, alacsony molekulatömegű I gandumok, sejtek, mikroorganizmusok és más biológiai anyagok nagy stabilitással és kihozatali;?! való i icgkötésérc egyidejű biokompatibilitás mellett. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás természetes és mesterséges polimer-anyagú hordozók felületén levő OH-csoportok aktiválására, oly módon,hogy b 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
