196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával
1 196 242 2 kielégítően alkalmazható a vírus-genóma RNS- másolatainak kimutatására. A 3. táblázat eredményeiből látható, hogy eljárásunk kiválóan alkalmas fertőzött sejtek vizsgálatára. E táblázat arra is rámutat, hogy ugyanazon reagensek alkalmazhatók mind a vírus-DNS mind az abból előállított rr RNS vizsgálatára. 3. Táblázat SV40 vírus kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével Szúrók (cpm) Minta 1) SV40 vírus , 2) Borjú-thymus 3) Vakpróba 1. Vizsgálat Ünearizált SV40 vírus DNS (50 mg) 20061 159 104 Minta nélkül — — . — 2. Vizsgálat SV40 vírussal fertőzött CV1 sejtek 40 órával a fertőzés után (106 sejt) 308í4 294 580 Nem fertőzött sejtek — — — Szűrők: 1) PstI restrikciós enzimmel emésztett SV40 vírus cirkuláris DNS-éből származó, rövidebb PstI B-fragmentum(0 ,2 pg) 25 2) 1 ng boíjú-thymus-DNS 3) Vakpróba (DNS nélkül) Jelzett nukleinsavreagens: Az SV40 vírus-DNS-ból származó hosszabb PstI 30 A-fragmentum, fajlagos aktivitása 28 x 106 cpm/pg- DNS (200 000 cpm U5J/reakció). • Hibridizálás: 35 Az 1. táblázathoz adott leírás szerint; a hibridizálás időtartama 4Ö óra volt, Mosás: 40 Az 1. táblázathoz adott leírás szerint. Minták: SV40 vírus-DNS-t (BRL) EcoRI restrikciós enzimmel (BRL) linearizáltunk. CV1 sejteket (Or- 45 vosbiológiai Központ, Upsala-i Egyetem) SV4G vírussal (Janice Y. Chou és Robert G. Martini, Bethesda) fertőztünk, és a fertőzés után 40 órával a sejteket összegyűjtöttük. A mintát az 1. táblázathoz adott leírás szerint kezeltük. 50 A táblázatban található értékeket úgy kaptuk, hegy ugyanígy elvégeztük a hibridizálási minta nélkül, és az így kapott háttér-hibridizálási értéke* két levontuk, 4. példa Bacillus amyloliquefaciens kimutatása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével (4. táblázat) A reagensek a B. amyloliquefaciens E18 (Finnországi Műszáki Kutatóközpont, VTT) a-amiláz génjének fragmentumai voltak, amelyeket a vizsgálat céljára a pKTHIO re kombi náns plazmidból (Palva, I. és munkatársai: Gene, 15, 43 (1981)) különítettük el úgy, hogy restrikciós enzimmel kezeltük, és ezt követően agaróz gélen elekíroforézist végeztünk. Vizsgálatunk céljára alkalmazott fragmentumok és a-amiláz gén Clal—EcoRI frag- , mentum-tertilete (460 bázispár) (Clal; Boehriinger Mannheim) és az EcoRI—BamHI fragmentum voltak (1500 bázispár). Az EcoRI—BamHI fragmentumot kötöttük a szűrőhöz, és a Clal—EcoRI fragmentumot ^J-izotóppal, „nick translation” (e'metszés +átviteli) módszer segítségével radicals tívan jeleztük. A 4. táblázatból látható, hogy a B. amyloliquefaciens a mintában sandwich hibridizálási eljárással, az egyedüli a-amiláz gén alapján azonosítható volt. A vizsgálat során az E. coli negatív eredményt adott (a háttérből nem volt megkülönböztethető). 4. Táblázat Baktériumok azonosítása a sandwich hibridizálási eljárás segítségével ________ Szúrók (cpm) Minta 1) G-aroiláz 2) Borjú- 3) Vakpróba ________-thymus________________ pKTH19 plazmid-DNS, linearizált (1 pg) 5773 Minta nélkül — E. coli HB101 (10* sejt) — Bacillus amyloliquefaciens (3x10* sejt) 3377 Bacillus amyloliquefaciens (10* sejt) 2871 7
