196242. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagenskombináció mikroorganizmusok azonosítására nukleinsavak sandwich-hidrolizációjával

1

196242

2

frcíó baktérium és vírus azonosítását lehetővé teszi egyidőben, ugyanazon minta felhasználásával, tekintet nélkül arra, hogy e mikrobák DNS-t vagy RNS-t tartalmaznak. A reagensek megfelelő kombinációjával lehetővé válik olyan készletek („kit”ek) kidolgozása (összeállítása), amelyekben minden egyes azonosítandó mikroba számára rendelkezésre áll a saját, szilárd hordozója (megfelelő befogó szerkezettel) és a jelzett nukleinsavreagens. A reagenskombinációban jelenlevő összes szűrök egyszerre adhatók a mintához a jelzett nukleinsavreagensekkel együttesen. A hibridizálás lejátszódása után a szilárd hordozókat kimossuk, és jelzésük erősségét megmérjük. Az az egyetlen hordozó válik jelzetté, amely a vizsgált mintában jelenlevő mikrobiális genómával komplementér szekvenciákat tartalmazza.

A találmány szerinti módszer és reagensek kombinációja felhasználható például az orvosi és állatorvosi mikrobiológiában, élelmiszerek egészségügyi vizsgálata és növénybetegségek kórokozóinak felderítése során. Minta céljára alkalmas anyagok például az összes állati és növényi szövetek homogenizátumai, betegek váladékai, például vér, széklet, továbbá az orr vagy a húgyvezeték nyálkahártyájából származó váladékok. Becslés alapján a találmány szerinti eljárás megfelelően érzékeny a klinikai mintákban normális körülmények között jelenlevő mikrobamennyíségek kimutatására, Természetesen lehetséges — és egyes esetekben lényeges — a mintában jelenlevő mikrobának tenyésztése útján való előzetes dúsítása az azonosítási vizsgálat végrehajtása előtt. A találmány szerinti eljárás olyan minták vizsgálatára is alkalmas, amelyekből származó mikrobák tovább már nem tenyészthetők, azonban számba vehető mennyiségű mikrobatörmeléket tartalmaznak (például antibiotikummal való kezelés megkezdése után), vagy ha a mikroba kitenyésztése különösen munkaigényes és nehéz (például anaerob baktériumok esetében, amelyek nagy mennyiségben vannak jelen anaerob kórokozók által okozott fertőzések gennyes váladékaiban.)

A találmány szerinti eljárás felhasználható például az alábbi reagenskombinációk (,,kit”-ek), azaz készletek alakjában amelyek egyes részei természetesen külön-külön is alkalmazhatók.

Légúti fertőzések:

a) Baktériumok:

Strepptococcus ß-haemolyticus (A-csoport), Haemophilus influenzae, pneumococcusok, Mycoplasma pneumoniae, mycobacteriumok;

b) Vírusok:

Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1—3, Virus syncyiialis respiratorius, adenovfrusok, coro naviru sok, rhinovirusok.

Hasmenéssel járó fertőzések:

a) Baktériumok:

salmonellák, shigellák, Wersinia enterocolitica,

E. coli enterotoxigenus, Clostridium difficile, campylobacteriumok; b) Vírusok:

rotavírasok, parvovírusok, adenovfrusok, enterovírusok;

f Nemibetegségek:

a) Baktériumok:

Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis;

b) Vírusok:

Herpex simplex vírus;

c) Élesztőgombák: Candida albicans.

d) Protozoák-.Trichomonas vaginalis.

Szepszis

a) Baktériumok:

Streptococcus ß-haemolyticus (A-csoport), pneumococcusok, entérobacteriumok mint egységes csoport.

Élelmiszer-egészségügy:

. a) Baktériumok:

Salmonella és Clostridium perfringens,

A reagensek megválasztásától függően a vizsgálati módszer specifitása korlátozható egy meghatározott mikrobatörzs (például salmonellák) vagy egy egész mikrobacsoport (például enterobacteriaceae) azonosítására úgy, hogy a közös gén területéről származó reagenseket választunk ki az azonosítás céljára.

A találmányunkban leírt sandwich hibridizálási eljáráshoz szükséges nukleinsav reagenseket a rekombináns DNS-eljárással álítjuk elő. Az alábbl: akban leírjuk az 1. példához szükséges reagens előállítását és a vizsgálati eljárást.

Reagensek

A KTL-ból, azaz a Helsinki-i Országos Közegészségügyi Intézetből (National Public Health Institute, Helsinki) származó 2. típusú adenovírust (ATCC VR—846) tenyésztettük, tisztítottuk és DNS-t izoláltunk (Pettérson, U. és Sambrock,

i.Mol. Bioi, 73, 125 (1973)/. Ezt a DNS-t a következőkben Adj—DNS-sel jelöljük. A DNS-t BamHI restrikciós enzimmel (BRL, Bethesda Research Laboratories) emésztettük, amely e DNS-t négy, reprodukálható fragmentumra hasítja. E tégy fragmentum közül kettót T4-ligáz enzim /BRL) segítségével a pBR322 vektor-plazmid :BRL) BamHI-helyére építettünk be. Ligáció ’kapcsolás) előtt a framgentumokat nem különítettük el, hanem a plazmidhoz adott, beépített részt minden egyes esetben a klónozás után azono-. sítottuk. Ezt követően a gazdabaktériumot (E.' coli HB101 (K12) gal-, pro-, leu~, hrs-, hrm-, recA, stri, F~; a KTL-ból kaptuk) rekombináns plazmidokat tartalmazó DNSplazmid-keverékkel, azaz olyan molekulákkal transzformáltuk, ame5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3