196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196 237 2 tilsára a reverz transzkriptázt Sl-nukleázzal kombinálva használjuk és bizonyos, korábban már leírt elkülönítési módszereket használunk (Ullrich és munkatársai, Science, 196, 1313,1966 és Seeburg és munkatársai, Nature, 270, 486, 1977). A kapott cDNS különböző hosszúságú molekulákból áll. Abban az esetben, ha az előállított és klónozandó cDNS nukleotid-sorrendje ismert vagy elfogadható valószínűségen belül jósolható, továbbá, ha a klónozott gén kezdeténél és végénél, viszonylag közel restrikciós helyek vannak, úgy megfelelő restrikciós enzimekkel hosszúság szempontjából homogén és a különböző szekvenciáktól elválasztható cDNS terméket tudunk előállítani. Érthető, hogy olyan gének, mint a korábban soha nem izolált és tisztított humán növekedési előhormon génjének nukleotid-sorrendjére vonatkozóan nem áll rendelkezésre információ, kivéve bizonyos kivételes eseteket. Ily módon az összes további lépést általában heterogén cDNS termékkel kell végeznünk. Előző adatokból megfelelő információ áll rendelkezésünkre a humán növekedési hormon cDNS molekula nukleotid-sorrendjéről (lásd. a 897 710 számú, Goodman és munkatársai által megadott leírást), ami lehetővé teszi a növekedési előhormon gén szubfragmenseinek azonosítását (iásd előbb). A humán növekedési előhormon aminosavai számának ismertében a megfelelő cDNS molekula körülbelüli hosszúságát 800 bázispárra becsüljük. A Pvu II és Bgl II jelű restrikciós enzimekkel való hasítást követően gélelektroforézissel kétszálú cDNS molekulákat különítünk el, ezek elsősorban a növekedési hormont meghatározó szekvenciákat tartalmaz. A cDNS molekula dezoxiribonukleinsav transzfer vektorba való beépítése bárhol történhet a vektoron, ahol endonukleázzal hasíthatunk, a beépítést dezoxiribonukleinsav-ligázzal katalizált úgynevezett „blunt”-végligációval végezzük (Sgaramella és munkatársai Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 67, 1468, 1970). A szelekciót egyszerűsítjük és a transzfer vektoron ismert helyekre való specifikus beépítéssel növel ük a hozamot a cDNS beépülési specifitásának különböző kezelésekkel való módosításával. Az előnyös kivitelezési változat szerint a plazmid transzfer vektornak egy restrikciós helye van, amely a használt marker génen belül helyezkedik el. A körkörös plazmid dezoxiribonukleinsavat megfelelő restrikciós endonukleázza! kezeljük. A cDNS molekula végeit hozzákötjük a nyitott plazmid dezoxiribonukleinsavhoz, amikor körkörös rekombináns plazmidot kapunk, amely a restrikciós helyre beépült cDNS molekulát tartalmazza oly módon, hogy a marker génbe van beépítve és ezzel ennek a génnek a funkciója elveszik. így például a pBR322 jelű plazmid egyétlen Hindii! restrikciós helyet tartalmaz, ez a tetraciklin rezisztenciát okozó gén promoter szakaszában helyezkedik el. A pBR322-vel transzformált E. coli sejtek képesek növekedni és osztódni 20 p/ml tetraciklint tartalmazó táptalajon. Ezzel szemben a nem transzformált sejtek hasonló körülmények között elpusztulnak. A HindiII helyen beépített dezoxiribonukleinsavat tartalmazó rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazó transzformált sejtek 20p/ml tetraciklin jelenlétében nem képesek növekedni és osztódni. A pBR322 plazmid ampiciliin rezisztenciát okozó gént is tartalmaz. Ezeknek a genetikai markereknek a kombinációi lehetővé teszik a transzformált sejtek elválasztását a nem transzformált sejtektől oly módon, hogy az ampiciliin jelenlétében csak az előzőek növekszenek, ezen felül lehetségessé válik a nem rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazó transzformált sejtek elválasztása a rekombináns pBR322 plazmidot tartalmazóktól oly módon, hogy tetraciklin jelenlétében csak az előző növekszik. A beépítési spccifitást és a hozamot a HindiiI enzimmel hasított pBR322 esetén növelhetjük oly módon, hogy a heterogén cDNS végeihez HindlII- kötó oligonukleotidokat kapcsolunk (lásd Scheller és munkatársai, előbb). Ezen felül a mellékreakciókat a rekombináns transzfer vektor képzésnél, például a cDNS molekula beépülése nélkül is bekövetkező gyűrűzárást vagy dimerizációt lényegesen csökkenthetjük oly módon, hogy a restrikciós enzimekkel hasított transzfer vektor dezoxiribonukleinsavat a 5'-terminülis foszfátcsoportok eltávolítására a végein előkezeljük, ahogy azt Shine a 898887 számú leírásban megadja. A fenti nódszereket kombinálva lényegesen növekszik az előállítani kívánt rekombináns transzfer vektor abszolút és relatív hozama. Az előző klónozási kísérletek során a cDNS terméket több egyénből gyűjtött sejtkivonatból származó hírvivő ribonukleinsavból szintetizálták. A jelen szabadalmi leírás értelmében a klónozott gént egyetlen személyből kapjuk. A találmány szerinti módszer lehetővé teszi a reakció méretének és a reakciótérfogatnak a csökkentését oly módon, hogy ez a terméket nem befolyásolja, továbbá nincs jelen a hordozó dezoxiribonukleinsav. Ez utóbbi meglepő módon növeli az általános kitermelést és a folyamat során használt enzimek által katalizált reakciók hatékonyságát. A hírvivő ribonukleinsavat egyetlen agyalapi mirigy tumorból izoláljuk Seeburg és munkatársai (lásd előbb) szerint. Az oszlopkromatográfiás lépést kis üvegcsőben végezzük, például Pasteur-pipettában. A fehérje eltávolítására használható tisztítási lépéseket ismert módszerekkel végezhetjük, például fenolos extrakcióval, előnyösen kloroformmal telített fenollal. A nukleinsavak töményítését alacsony hőmérsékleten alkoholos kicsapással végezzük, előnyösen etanollal -70°C hőmérsékleten. Mind a reakciósort, mind pedig a kicsapást egyetlen csőben végezzük, előnyösen alul szűkülő, műanyag, 1 —2 ml össztérfogatú centrifugacsőben. Az enzimreakciókat, például a reverz transzkriptázzal való reakciót szintén kistérfogatú reakciócsőben végezzük. Az egyszálú és a kétszálú cDNS molekulák szintézisének sebességét és mértékét általában a naszccnsz cDNS izotóppal való jelölődésével követjük. A jelölést előnyösen P32- jeizett foszfáttal végezzük, ez a nukleotid-trifoszfát prekurzorok egyikébe a-heiyzetbe épül be. Előnyösen például a-P32—dCTP-t használunk. A rádióaktív jelzéssel lehetségessé válik a cDNS termék kromatografáló oszlopon és elektroforetikus gélen való elmozdulásának követése is. Ahol több oszlopkromatográfiás frakciót kell vizsgálnunk a kísérletek során, például kromatográfiát követően 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
