196237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán növekedési előhormon előállítására
1 196237 2 A találmány tárgya eljárás előszekvenciát tartalmazó emberi növekedési hormont meghatározó gént tartalmazó mikroorganizmussal a hormon előállítására. A klónozott gént a gazda mikroorganizmus kifejezi abban az esetben, ha általa kifejezhető prokariota génnel fuzionáljuk. A gént terápiás célokra felhasználható humán növekedési hormon előállítására használjuk. A növekedési hormont az agyalapi mirigy anterioláris lebenye termeli, adenohipofízisnek is nevezik. A hormont normális körülmények között egész életen át termeli a mirigy, bár gyermekkorban nagyobb mennyiségben. Bár hatásmechanizmusa részleteiben nem ismert, tudjuk, hogy a növekedési hormon befolyásolja a glükóz és a lípidek metabolizmusát és elősegíti a protein szintézist. A növekedési hormon hiányára visszavezethető különböző betegségek ismeretesek. Az agyalapi mirigy elváltozásánál alapuló törpenövekedés súlyosabb eseteit halottakból izolált emberi növekedési hormonnal kezelik. Mivel a nem főemlősökből származó növekedési hormonok emberben nem hatásosak, nincs megfelő forrása. Az anyaggal való ellátottság igen szegényes, a hormon izolálása és tisztítása bonyolult és drága. Egy beteg egy évi kezelése, becslések szerint 5000 ezer dollárba kerül. így jelenleg a növekedési hormon hiánya miatt fellépő betegségek kezelése a legsúlyosabb esetekre korlátozódik. Minden évben több mint ezer új beteg igényelne kezelést. Abban az esetben, ha elfogadható áron megfelelő mennyiségű hormon állna rendelkezésünkre, úgy becslések szerint további 10 000 kevésbé súlyos elváltozásokban vagy más növekedési problémákkal küszködő beteg kezelése lenne megoldható. Ezen kívül bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a humán növekedési hormont előnyösen használhatjuk fel a gasztrointesztinális vérzések, a törések, a metabolikus eredetű csontbetegségek, sebek gyógyítására. A növekedési hormon egy protein. Az ismert módszerekkel meghatározott emberi növekedési hormon aminosav-sörrendjét az 1. táblázatban adjuk meg. /. Táblázat 1 NH2 - The - Pro - Thr - Ile - Pro - Leu - Ser - Arg - 10 - Leu - Phe - Asp - Asn - Ala - Met - Leu - Arg - Ala -20- His - Arg - Leu - His - Gin - Leu - Ala - Pile - Asp -30- Tlir - Tyr - Glu - Glu - Phe - Glu - Glu - Ala -Tyr -40 - He - Pro - Lys - Glu - Gin - Lys - Tyr - Ser - Phe -50- Leu - Gin - Asn - Pro - Gin - Thr - Scr - Leu - Cys -60- Phe - Ser - Glu - Ser - Ile - Pro - Thr - Pro - Ser -70- Asn - Arg - Glu - Glu - Thr - Gin - Gin - Lys - Ser-80 -Asn-Leu-Gln-Leu-Leu-Arg -Ile-Ser-Leu- Len -90- Leu - Ile - Gin - Ser - Tyr - Leu - Glu - Pro - Val -- Glu - Phe - Leu - Arg - Ser - Val - Phe - Ala - Asn - 100 - Ser - Leu - Val - Tyr - Gly - Ala - Ser - Asn - Ser -110 - Asp - Val - Tyr - Asp - Leu - Leu - Lys - Asp - Leu -120 - Glu - Glu - Gly - Ile - Gin - Thr - Leu - Met - Gly -130- Argr Leu - Glu - Asp - Gly - Ser - Pro - Arg - Thr -- Gly - Gin - lie - Phe - Lys - Gin - Thr - Tyr - Ser -150- Lys - Phe - Asp - Thr - Asn - Ser - His - Asn - Asp -160 - Asp - Ala - Leu - Leu - Lys - Asn - Tvr - Gly - Leu -170 - Leu - Tyr - Cis - Phe - Arg - Lys - Asp - Met - Asp -180 Lys - Val - Glu - Thr - Phe - Leu - Arg - He - Val -Gin - Cys - Arg - Ser - Val - Glu - Gly - Ser - Cys - 190 191 Gly-Phe-COOH. Az ismert módszerekkel ennek a 191 aminosavbó! álló fehérjének kémiai szintézise nem megoldható. Az agyalapi mirigyben az eredeti bioszintetikus termék az úgynevezett pre-növekedési hormon és ez az 1. táblázatban megadott aminosavakon kívül 26 aminosavból álló további, szignálpeptidnek nevezett és az amino-terminális véghez k apcsolódó szekvenciát tartalmaz. A szignálpeptid aminosav szekvenciája a következő:-26 -20 NH, - Met - Ala - Thr - Gly - Ser - Arg - Thr - Ser - -15 -10 - Leu - Leu - Leu - Ala - Phe - Gly - Leu - Leu - Cys --5 -1- Leu - Pro - Ti p - Leu - Gin - Glu - Ala - Val - Pro A 26 aminosavból álló szignálpeptid funkciójára vonatkozóan az az álláspont, hogy ez lehetővé teszi a sejtmembránba való belépést és áthaladást, ezzel lehetségessé válik a protein kiválasztása abból a sejtből, amelyben szintézise történik (lásd: Elobei és munkatársai, J. Cell. Biok, 67. 835. 1975.) Az eukarióta fehérjék kapcsán több példa ismeretes szignálpeptidekré vonatkozóan, ezek a membránon való áthaladást segítik elő. Sejtmentes rendszerben specifikusan működő hasító enzimet figyeltek meg, amely hidrolizálja az aktív protein és a szignálpeptid közötti peptidkötést, miközben az áthalad a sejtmembránon (lásd: Blobel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei, USA, 75, 361. 1678.) A biokémiában és a rekombindns dezoxiribonuktcinsav technológiában napjainban tapasztalt fejlődés lehetővé teszi különleges proteinek szintézisét olyan szabályozott körülmények között, amelyek függetlenek attól a magasabbrendű szervezet5 10 15 20. 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
