196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 190236 2 bázispáros fragmenst lágy agaróz eleklrofcrézissel tisztítjuk (0,8% agaróz gél). 5 Mg pBR322/P7/05 Bal-Sam plazmidot [100 561 sorozatszámú Európa szabadalmi bejelentés] emésztünk Sail és Av.ví restrikciós endonukleázokkal (a pBR322 1424. helyzete), Az így létrejött 3,9 kb-s vektor fragmenst, amely pBR322 szekvenciákat tartalmaz a PH05 Bam-Sal szegmenssel együtt, lágy agaróz eiektroforézisse! tisztítjuk. 1 pg 1336bázispáros fragmenst ligálunk 3 pg3,9 kb-s vektor-fragmenssel 50 pl oldatban, amely 60 mmól/1 írisz—HCi-t, (Ph 7,5), 10 mmól/A MgCLt, 10 mmól/1 DTT-t, 1 mmól/1 ATP-t és 600 egység T4 DNS ligázt (Biolabs) tartalmaz 15 °C hőmérsékleten 4 órán át. Az E. coli HB101 transzformálását az „1. plazmid” ampicillin-reziszteneia szerinti izolálására hajtjuk végre ezután. A plazmid korrekt szerkezetét azután restrikciós elemzéssel erősítjük meg. Abból a célból, hogy az ,,1. p!azmid”-ban jelen levő PH05 fehérje kódoló területei eltüntessük, 5 pg plazmidot emésztünk KpnI restrikciós endo* nukleázzal (a felhasználás feltételeit a szállító, a New England Biolabs, részletesen leírja), hogy iineaüzált plazmidot nyerjünk. 4 pg Iineaüzált plazmidot emésztünk í egység BAL 31 exonukleázzai (Bethesda Research Laboratory) 30 °C hőmérsékleten 45 másodpercen át egy olyan oldatban, amely 12 mmól/1 CaCl2-t, 12 mmólA MgCi2-t, 300 mmóS/! NaCl-t, 20 mmól/1. trisz-t, és 1 mmól/1 EDTA-t tartalma/ (pH 8,1), a reakció közeg össztérfogata 100 pl. A reakciót fenolos etrakcióval állítjuk le. Etanolos kicsapás után a DNS-t újra szuszpendáljuk 50 pl TE-ben. 1 g DNS-t újra köralakúvá alakítunk T4 DNS ligázzal végzett ügálással 20 pl térfogatban, így állítjuk elő a „2. p!azmid”~ot. Az E. coli HB101 transzformálása után a „2. plazmid”-dal ampicillin rezisztenciára a DNS-t izoláljuk és az egyes plazmid készítményeket restrikciós elemzéssel elemezzük a következő enzimekkel: tfadll, Psil, BsíEU és Hhal. Ez az elemzés lehetővé teszi a Hhal hely jelenlétének meghatározását (6 bázispárra! a HBsAg fehérje kódoló terület rajtja előtt), és megadja a deléció méretének nagyságát. A DNS szekvenciát a csatlakozási területen Maxam és Gilbert módszerét alkalmazva határozzuk meg [A. M. Maxam és \V. Gilbert: Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)]. A „2. p!azmid”-ból 5 ug-ot emésztünk őamHI restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs, a feltételeket a szállító útmutatása szerint szabjuk meg). Egy 1,8 kb-s ŐamHí fragmenst készítünk lágy agaróz gél elektroforézissel (0,8% agaróz). 2 pg pjD207 „ingázó” vektort emésztünk ugyanezzel az enzimmel, i pg emésztett pJDB207-et és 1 pg fentebb előállított 1,8 kb-s restrikciós fragmenst ligálunk 20 pg össztérfogatban. Ezután E. coli HBlOl-et transzformálunk ampicillin rezisztenciára , maid a plazmid DNS-t izoláljuk, A plazmidokat egyenként elemezzük BamHl restrikciós elemzéssel, és a beiktatott BamHl restrikciós fragmens orientációját HindlWBstEU kettős emésztéssel határozzuk meg. Ezzel válik lehetővé a „3.plazmid” kiválasztása. A „3. plazmid”-ot az AH220 élesztótörzsbe transzformáluk. A transzformált élesztósejteket kiválasztjuk, folyékony tápközegben inkubáljuk és derepresszáló körülmények közt növesztjük, és a transzformált élesztőtelepeket kiválasztjuk. Sejt-extratuniokat készítünk és a termelt HBsAg fehérje mennyiségét meghatározzuk Abbot readioimmunassay-t alkalmazva (Grough és munkatársai fentebb idézett munkája). Ez bizonyítja a HBV antigenicitását mutató polipeptidek le midé se t éle sztó kbe n. C. példa Ebben a példában eljárást írunk le hepatitisz B antigének („HBsAg”) fajlagosságával rendelkező polipeptidek előállítására állati sejtekben. Kínai hörcsög petefészek (CHO) sejteket transzformálunk egy olyan kiónozó hordozóval, amely tartalmazza azt a DNS-t, amely HBsAg polipeptideket kódolja. Ez lehetővé teszi, hogy a beiktatott DNS fragmens rcplikáiódjék és kifejeződjék az emlős gazdasejtben, és HBsAg polipeptideket termeljen. Ez a példa a CHO sejtek, amelyek nélkülözik a dihidrofolát reduktázt (DHFR-) együtt-transzformálásáí alkalmazza [G. Urlaub és L. A. Chasin: Pros. Natl. Acad. Sei. USA, 77, 4216-20 (1980)] két plazmáddal, a pAdD26SV(A)—3-maí [R. J. Kaufman és P. A. Sharp. J. Mol. Biol. 159, 601 — 621 {*.982)) és a jelen találmány szerinti „2. plazmid-dal. amely a HbsAg polipeptideket kódolja. Az ehhez az együtt-transzformáláshoz alkalmazott CHO (I)HFR') sejteket 37 °C hőmérsékleten tartjuk rent szüvettenyésztó palackban (Gibco), amely alfa minimál esszenciális tápközeget (MÉM) (Gibco. 072—1900 katalógusszám) tartalmaz, 10% borjú embrió .szérummal (FCS) és 50 pg/ml gentamicinoel kiegészítve. A transzformánsokat alfa MEM-ben [amelyből hiányoznak a ribonukleozidok és a dezoxiribonukleozidok (Gibco,072 — 2000 katalógusszám)] és 10% dializált FCS-bers tenyésztjük. Az utóbbi tápközegre „szeiektfv iáDközeg"-ként hivatkozunk. , HBsAg kódoló plazmidokaf állítunk elő pl. olyan módon, hogy a HBsAg kódoló szekvenciát (amint ezt ebben a bejelentésben leírtuk) beiktatjuk egy módosított pSVz-dhfr-be [S. Subramani és munkatársai: Mol. Cell, Biol. 1, 854—64 (1981)]. Az így keletkezett plazmid a HBsAg kódoló szekvenciát közvetlenül az SV 40 korai promotortól „lefelé” és az SV4Û összeillesztési helyektől és poliadenilezési szignáltól „fölfelé” tartalmazza. Az együtt-transzformáláshoz alkalmazott másik plazmid, a pAdD26SV(A)—3, az egér DHFR kódoló szekvenciát tartalmazza. Ez a sejtet DHFR fenotípusűvá transzformálja, amint ezt a transzíormánsnak az a képessége demonstrálja, hogy nő a „szelektív tápközeg”-ben (abban a tápközegben, amely nélkülözi a ribonukleozidokat és a dczoxiribonukleozidokat). Olyan módszert alkalmazunk, amely hasonlít a Graham és van der Eb által leírt módszerhez, hogy együtt transzformáljuk a CHO sejteket [F. L. Graham és A. J. van der Eb: Virology, 54, 536—39 (1973)]. Először szövettenyésztó lombi5 0 ’5 10 25 39 35 40 45 50 55 60 65 15
