196229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az A 40926 antibiotikum N-acilamino-glukuronil-aglikonjai és az A 40926 antibiotikum aglikonjai, valamint az ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196229 2 230 mesh, Merck Inc.), amelyet A oldattal előzetesen egyensúlyba hoztunk (0,25 súly/térf. % NaH2PC>4 • H20-t és 2,5 tőmeg/térf. % NaCl-t tartalmazó, NaOH-dal pH 6,0-ra beállított 0,001M vizes Na—EDTA oldat). Az oszlopot lineáris grádiens alkalmazásával eluáljuk (0%—40% — téri./ térf.-acetonitril az A oldatban); össztérfogat kb. 7 liter, kb. 48 óra alatt. Kb. 15,5 ml-es frakciókat szedünk; ezeket Bac. subtilis alkalmazásával biológiai vizsgálatnak vetjük alá és HPLC-vel elemezzük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük. A 310—330 frakció tartalmazza az említett antibiotikumok közül az A 40926 antibiotikum A faktort, a 348—365 frakció pedig az A 40926 antibiotikum B frakciót. B) az A 40926 antibiotikum A faktort, illetőleg az A 40926 antibiotikum B faktort tartalmazó egyesített frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük az acetonitril eltávolítására, vízzel hígítjuk (a kiindulási oldatok térfogatának kb. kétszeresére) és felvisszük az előbbiekben leírt típusú szilanizált szilikagél oszlopra (a duzzasztott mátrix térfogata: 50 ml; az ágy magassága 15 cm). Az oszlopot a sók teljes eltávolításáig ionmentesített vízzel mossuk, majd 60:40 (térf./térf.) acetonitril:víz eleggyel fejlesztjük ki. Az eluált frakciókat csökkentett nyomáson betöményítjük és a maradékot fagyasztva szárítjuk. Az eluált frakciók első csoportjából (az előbbi 310—330 frakció) 134 mg A 40926 antibiotikum A faktort, az eluált frakciók második csoportjából (az előbbi 348—365 frakció) pedig 206 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk. 5. eljárás Az A 40926 antibiotikum PA és PB faktor elkülönítése Lényegében a 2. A) eljárást és a 2. B) eljárás első lépései szerinti műveleteket követve a gyantához kötött antibiotikumot 2x20 liter 1 tömeg/térf.%os ammóniumhidroxiddal eluáljuk. Az eluátumok pH-ját kénsavval 7,8-re állítjuk be és az oldatokat vákuumban, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be; így vizes tömény oldatot kapunk, amelyet papíron szűrünk. A kapott szűrlet az A 40926 antibiotikum PA faktort, az A 40926 antibiotikum PB faktort, valamint kisebb mennyiségű A 40926 antibiotikum A faktort és B faktort tartalmaz (HPLC). Ebből a vizes koncentrátumból egy mintát (10 ml), amely kb. 50 mg/ml tiszta A 40926 antibiotikum komplexet (HPLC elemzés) tartalmaz, 5 pm pórusméretű szűrőn (AcrodiscR, Gelman Science Inc.) szűrünk, majd a szűrletet felvisszük egy 2 cm átmérőjű saválló acél oszlopba töltött 20 g oktadecíl-szilil fordított fázisú szilikagélre (Lichrosorb RP 18, Merck Inc.; részecskenagyság 10 pm). A szilikagélt ezután mérsékelt nyomáson (névleges nyomás kb. 14 bar) betöltjük egy Chromatospac Modulprep berendezés saválló acél oszlopába (Joben Yvon, Franciaország) és kiegyensúlyozzuk egy olyan eleggyel, amely 25:75 (térf./térf.) arányban acetonitrilt és 18mM pH 6,0 nátriumfoszfát puffert tartalmaz. Az eluálást ugyanannak az oldószerelegynek az alkalmazásával hajtjuk végre, amelyet a kiegyensúlyozáshoz használtunk fel; áramlási sebesség kb. 10,5 ml/perc. Az elúciót Bac. subtilis-szel végzett biológiai vizsgálattal és HPLC-vel követjük. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat összeöntjük és 5 kromatográfiás futtatás homogén frakcióit betöményítjük, a szerves oldószer eltávolítására. A kapott oldatot 1M nátriumkloriddal az eredeti térfogat kétszeresére hígítjuk és ezt az oldatot felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (50 g; ágymagasság 5 cm; szilanizált szilikagél 60, Merck Inc.), amelyet vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot a sók teljes eltávolításáig (vizes AgNCb hozzáadása után az eluátumokban nem jelenik meg AgCl csapadék) ionmentesített vízzel mossuk, majd 1:1 térf./térf. acetonitril: víz eleggyel eluáljuk. Á hasonló antibiotikum-tartalmú eluátumokat (HPLC elemzés) ezután összeöntjük, n-butanollal végzett azeotróp desztillációval kis térfogatra töményítjük be és így egy vizes fázist kapunk, amelyet fagyasztva szárítunk. Kitermelések: — A 40926 antibiotikum PA faktor: 55 mg — A 40926 antibiotikum PB faktor: 51 ml — A 40926 antibiotikum A faktor: 38 mg — A 40926 antibiotikum B0 faktor: 33 mg. 6. eljárás Alternatív eljárás az A 40926 antibiotikum B faktor elkülönítésére A 2. eljárás szerint két kísérletet végzünk és az utolsó lépésből származó összeöntött koncentrátumot szűrjük, majd a szűrletet felvisszük egy szilanizált szilikagél oszlopra (400 g; az ágy magassága 30 cm; szilikagél 60, 70—230 mesh, Merck Inc.), amelyet előzetesen vízzel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 6 liter vízzel öblítjük át és az adszorbeált antibiotikumot acetonitril:víz eleggyel eluáljuk, a következő sorrend szerint : — 2,7 liter 5 térf./térf.% acetonitril vízben — 1,6 liter 10 térf./térf.% acetonitril vízben — 2,97 liter 15 térf./térf.°7o acetonitril vízben — 3,15 liter 20 térf./térf.% acetonitril vízben Kb. 18 ml-es frakciókat szedünk. Az eluált frakciók aktivitását papírkorongos biológiai elemzéssel, érzékeny mikroorganizmusok (pl. Bac. subtilis) alkalmazásával határozzuk meg, illetőleg HPLC-vel vizsgáljuk. A hasonló antibiotikum-tartalmú frakciókat (472—526) összeöntjük és az oldatot csökkentett nyomáson betöményítjük. Ehhez a koncentrátumhoz n-butanolt adagolunk a víz azeotrópos eltávolítására. A visszamaradó butanolos oldatot kis térfogatra töményítjük be az A 40926 antibiotikum B faktor (1,4 g) kicsapására. Ezt a terméket petroléterrel mossuk, kevertetés mellett, és szűréssel gyűjtjük össze (háromszor). Vákuumban való szárítás után 760 mg A 40926 antibiotikum B faktort kapunk. Ha az A 40926 antibiotikum B faktort az előbbi oszlopkromatográfiás eljárásnak vetjük alá, 540 mg A 40926 antibiotikum B 0 faktort kapunk végtermékként, amely az előbbiekben az A 40926 antibiotikum B faktorra vonatkozóan közölt fizikokémiai tulajdonságokkal rendelkezik, azzal az eltéréssel, hogy HPLC elemzés során csak egy csúcsot mutat, nevezetesen azt a csúcsot, amelynek retenciós ideje a teikoplanin Á2 2 komponenshez viszog, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 21
